Karakterisering van tumorcellen met behulp van een medische draad voor het vastleggen van de circulerende tumorcellen: een 3D aanpak gebaseerd op immunofluorescentie en DNA vis

Het algemene doel van dit protocol is om immunofluorescentiekleuring te combineren met DNA-fluorescentie in situ hybridisatie op een 3D gefunctionaliseerde draad en om immunofenotype en FISH-signalen op de ondersteuning te identificeren met behulp van een conventionele breedveldfluorescentiemicroscoop. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van secretoire tumorcelkarakterisering te beantwoorden, zoals het identificeren van therapiegerelateerde doelen op circulerende niet-kleincellige longkankercellen. Het grote voordeel van dit protocol is dat het de gelijktijdige identificatie van fenotypische parameters zoals EpCAM-positiviteit en cytosomatische veranderingen zoals ARC-genstatus mogelijk maakt om veronderstelde CTC's te detecteren.

Hoewel deze methode uniek is ontworpen om in situ insuline-kanker CTC-kenmerken te bieden, kan deze ook worden toegepast op het onderzoek van andere kanker zoals borstkanker. We ontwikkelden dit protocol tijdens het hanteren van de draad voor directe immunofenotypering en CTC-detectie. Om meer gegevens te verkrijgen, hebben we een immunofenotyperingsprotocol gecombineerd met een DNA-fluorescentie in situ hybridisatieprotocol.

Het hanteren van de draad is niet eenvoudig, voornamelijk omdat het gefunctionaliseerde uiteinde kwetsbaar is. Een visuele demonstratie zal de lezers helpen de stappen te reproduceren. Om het experiment te beginnen, hersuspendeer de volledige inhoud van een T75-kolf die 80% confluentie heeft in een vijf milliliter vial met behulp van vier milliliters compleet medium.

Verwijder vervolgens de draad uit de glazen verpakking. Dompel het gefunctionaliseerde gouden deel van de draad in de vial, zorg ervoor dat de draadstopper een waterdichte pasvorm heeft voor een vijf milliliter vial. Verzegel de draad met laboratoriumfolie.

Incubeer vervolgens de draad gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een buisrotor. Na de rotatie, spoel de draad drie keer af in eenvoudig PBS-oplossing met behulp van drie verschillende schone vials en wacht tot de draad is opgedroogd. Na het 10 minuten laten drogen van de draad in een afzuigkap, fixeer de cellen door de draad 10 minuten in een 100% acetonoplossing in een vijf milliliter buis te dompelen bij kamertemperatuur.

Zorg ervoor dat er geen spoor van aceton op het gefunctionaliseerde uiteinde is. Laat de draad 5 minuten op kamertemperatuur drogen. Was vervolgens de draad twee keer in eenvoudig PBS in een vijf milliliter buis.

Incubeer de draad in antilichaamverdunningsbuffer. Bereid 150 microliters antilichaammix met een verdunning van monoklonaal primair antilichaam geconjugeerd met fluorochroom en antilichaamverdunningsbuffer zoals gespecificeerd in de datasheet. Gebruik vervolgens een P200 tip om de draad uit de draadstopper te extraheren en voer de draad voorzichtig door het grotere gat van de tip.

Voer het niet-gefunctionaliseerde uiteinde eerst in en trek de draad langzaam door het kleinere gat totdat het gouden deel net voorbij het grotere gat komt. Voeg voorzichtig 150 microliters van de antilichaammix toe aan de tip. Om het risico van bubbelvorming te vermijden, draai de draad voorzichtig totdat het gefunctionaliseerde uiteinde volledig is ondergedompeld.

Verzegel het gat van de tip en wikkel laboratoriumfolie rond het gat. Incubeer de draad verticaal gedurende een nacht in het donker bij vier graden Celsius. Op de tweede dag, blokkeer de antilichaamincubatie door de draad twee keer in eenvoudig PBS te wassen.

Plaats de draad opnieuw in zijn draadstopper. Drie uur voor het DNA-FISH-protocol, stel de hybridisatieoven in op 75 graden Celsius en stel de droogteoven in op 37 graden Celsius. Koel de 0,4-voudige SSC-oplossing af tot vier graden Celsius.

Was de draad drie keer in ijskoud 0,4-voudig SSC-oplossing. Droog de draad 10 minuten in het donker onder de afzuigkapkast. Na 10 minuten, vortex en draai de sonde gedurende vijf seconden.

Laat 10 microliters van de sonde vallen in glazen microbuisjes en bedek ze vervolgens met laboratoriumfolie. Wikkel de microbuisjes in droog absorberend papier. Plaats ze in een 50 milliliter buis en draai ze kort door.

Plaats de gedrooide draad voorzichtig in het microbuisje en steek de draadstopper erdoor. Verzegel de draadstopper vervolgens met rubbercement. Plaats de draad in een donkere vochtige kamer in de hybridisatieoven gedurende acht minuten bij 75 graden Celsius om volledige DNA-denaturatie te verkrijgen.

Na acht minuten, verplaats de vochtige kamer naar een droogteoven bij 37 graden Celsius voor een nacht. Plaats de schuifkleuringsvat met 0,4-voudig SSC-oplossing in een waterbad ingesteld op 72 graden Celsius. Controleer de temperatuur van de 0,4-voudig SSC-oplossing totdat deze 72 plus of min één graad Celsius bereikt.

Bereid vervolgens twee glazen bekers voor. Een met tweevoudig SSC plus 0,05% Tween-oplossing en de tweede met gedistilleerd water. Verwijder de vochtige kamer voor de droogteoven.

Gebruik pincetten om voorzichtig het rubbercement van de draadstopper te verwijderen en trek het niet-gecoate uiteinde van de draad door de eindstopper, zorg ervoor dat u het gefunctionaliseerde uiteinde niet beschadigt. Dompel de draad twee minuten in de 0,4-voudig SSC-oplossing bij 72 graden Celsius. Was de draad 30 seconden in tweevoudig SSC plus 0,05% Tween-oplossing bij kamertemperatuur.

Was vervolgens de draad in gedistilleerd water bij kamertemperatuur. Droog de draad 10 minuten in het donker onder de afzuigkap. Incubeer het gefunctionaliseerde uiteinde van de draad met eerder bereide DAPI-oplossing in een tweedubbele milliliterbuis.

Spoel de draad twee keer af in eenvoudig PBS en laat de draad drogen. Plaats de draad in de draadhanger en voer voorzichtig het gefunctionaliseerde uiteinde in via het invoerpunt van de speciale houder totdat het uiteinde overeenkomt met het koppelpunt. Plaats de special