Oppervlakte Functionalization van Hepatitis E Virus nanodeeltjes met behulp van methoden voor chemische Woordherkomst en-opbouw

Het algemene doel van de chemische functionalisering van het oppervlak van HEV-nanodeeltjes is het bieden van een reproduceerbare en consistente methode voor de conjugatie van targetende immunogene, therapeutische en diagnostische moleculen aan het oppervlak van HEV-nanodeeltjes voor diagnostische en therapeutische doeleinden.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de nanomedicijn, zoals de vraag hoe verbeterde targeting van kanker en de distributie van nanotherapeutica kunnen worden gemonitord. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze zeer reproduceerbaar en efficiënt is, en veel eenvoudiger te realiseren is in vergelijking met genetische manipulatie.

De procedures zullen worden gedemonstreerd door Michelle Nguyen en Ivan Ruiz, research assistants uit ons laboratorium.

Begin dit protocol met de productie en zuivering van hepatitis E-virusnanodeeltjes zoals beschreven in het tekstprotocol.

Verdun de HEV-nanopartikelmonsters tot een concentratie tussen 0,5 en 2 mg/mL met 10 mM MES, pH 6,2 voor TEM-beeldvorming. Ioniseer de koolstofgecoate grids met een glow discharge van 40 mA gedurende 30 seconden om een hydrofiel koolstofoppervlak te verkrijgen. Het hydrofiele koolstofoppervlak van de grids is slechts 30 minuten houdbaar na de glow discharge-behandeling. Houd na ionisatie de grid en de pincet vast en breng 2 µL van het HEV-nanopartikelmonster aan op de grid.

Dep na 15 tot 30 seconden het raster af met filterpapier. Was het raster vervolgens onmiddellijk met dubbel gedestilleerd water en dep het opnieuw af met filterpapier. Voeg onmiddellijk twee microliter twee procent uranylacetate toe aan het raster. Dep het raster na 15 seconden af met filterpapier. Droog de monsterroosters door ze overnight in een elektronische ontvochtigingskast te plaatsen.

Afhankelijk van het monster kan cryogene elektronenmicroscopie of cryo-EM noodzakelijk zijn voor de visualisatie en karakterisering van de structuur. Plaats het raster in een TEM en maak beelden bij een vergroting van 10 tot 80K. HEV-nanodeeltjes verschijnen in TEM als lege icosahedrale eiwitten met een diameter van ongeveer 27 nanometer vanwege de afwezigheid van viraal RNA.

Om de eenstaps conjugatie van HEV-nanodeeltjes en maleïmide-gekoppeld biotine uit te voeren, worden de HEV-nanodeeltjes eerst in minidialyse-eenheden geplaatst. Dialyseer de nanodeeltjes tegen 0,01 M PBS pH 7,4 bij kamertemperatuur gedurende één uur volgens het protocol van de fabrikant. Breng de HEV-nanodeeltjes na dialyse over in 1,5 ml buisjes en meet de eiwitconcentratie bij 280 nm met behulp van een spectrophotometer. Meng de nanodeeltjes in een concentratie van 1 mg/ml met een gelijke hoeveelheid 100 µM maleïmide-biotine en 0,01 M PBS pH 7,4 om een molaire ratio van 1:5 te verkrijgen. Na een nacht laten reageren bij 4 °C, wordt ongebonden maleïmide-biotine verwijderd middels een spin-desaltingkolomprocedure volgens het protocol van de fabrikant. Analyseer de monsters via een standaard reducerende SDS-PAGE.

Bereid volgens de standaardprocedures een chemiluminescente Western blot voor met gebruik van HRP-gekoppelde streptavidine en leg het chemiluminescente signaal vast met een röntgenfilm.

Om de tweestapsconjugatie van de borstkankercel-specifieke ligand, LXY30, aan oppervlakte-blootgestelde cysteïne op HEV-nanodeeltjes uit te voeren, worden de nanodeeltjes eerst in minidialyse-eenheden geplaatst en gedialyseerd tegen 0,01 molair PBS pH 7,4 bij kamertemperatuur gedurende één uur. Breng vervolgens de HEV-nanodeeltjes over in 1,5 milliliter buisjes en meet de eiwitconcentratie bij 280 nanometer met behulp van een spectrofotometer. Combineer daarna 650 micromolair maleïmide-azide en 650 micromolair alkyn-LXY30 met 200 micromolair kopersulfaat en één millimolair ascorbinezuur. Hierdoor wordt maleïmide-gekoppeld-LXY-30 gevormd met een concentratie van 650 micromolair. Incubeer het mengsel gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Meng de volgende dag de HEV-nanodeeltjes met een concentratie van één milligram per milliliter met ongeveer 10% volume van maleïmide-gekoppeld LXY30 om een molaire ratio van één op drie te verkrijgen. Laat dit gedurende de nacht reageren bij vier graden Celsius. Vanwege de relatief hoge concentratie van maleïmide-LXY30 worden de uiteindelijke concentraties van de reactanten, zoals kopersulfaat, na het mengen ongeveer 10 keer verlaagd. Om beschadiging van de hepatitis E-virusnanodeeltjes te voorkomen, is een andere optie de koper-vrije conjugatiemethode.

Verwijder ongebonden maleïmide-click LXY30 met een spin-ontzoutingskolom volgens het protocol van de fabrikant. Bewaar de LXY30-gekoppelde HEV-nanodeeltjes bij vier graden Celsius. Om een éénstapsconjugatie van de LXY30 HEV-nanodeeltjes en de Cy5.5-fluorescente tag uit te voeren, mengt u eerst de LXY30-gekoppelde nanodeeltjes met een concentratie van één milligram per milliliter met een gelijk volume Cy5.5-fluorescente tag om een molaire ratio van één op vijf te verkrijgen. Nadat het mengsel een nacht bij vier graden Celsius heeft gereageerd, verwijdert u de ongebonden Cy5.5 NHS via een spin-ontzoutingsprocedure volgens het protocol van de fabrikant. Bewaar de LXY30 Cy5.5-gekoppelde HEV-nanodeeltjes bij vier graden Celsius.

Er werden twee methoden geprobeerd voor de LXY30-functionalisering van HEV-nanodeeltjes voor tumorceltargeting. Wanneer HEV 573C-nanodeeltjes eerst werden gebonden aan maleïmide-azide, gevolgd door een clickchemische reactie met LXY30-alkyn, leken de HEV 573C-nanodeeltjes onder TEM-observatie uiteen te vallen. Een initiële clickchemische reactie tussen LXY30-alkyn en maleïmide-azide om maleïmide-gekoppeld LXY30 te vormen, gevolgd door conjugatie aan assist-gemodificeerde HEV-nanodeeltjes, had echter geen invloed op de structuur en de HEV 573C-nanodeeltjes bleven intact. LXY30- en Cy5.5-gekoppelde HEV-nanodeeltjes werden toegepast op gekweekte borstkankercellen en geobserveerd met confocale microscopie. De nabij-infrarood fluorescentiebeelden via confocale microscopie wijzen erop dat LXY30 Cy5.5-gekoppelde HEV-nanodeeltjes een hogere bindingsaffiniteit hadden voor een verhoogde internalisatie in MDA MB-231 borstkankercellen vergeleken met Cy5.5-gekoppelde HEV-nanodeeltjes.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot het onderzoek naar multimodale targeting en therapeutische moleculen, die nauwkeurige targeting en diagnose van tumoren mogelijk maken zonder schade aan normale cellen te veroorzaken. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in kanker en tumor-targeting via chemische oppervlaktemodulatie, kan deze worden toegepast bij vroege kankerdiagnostiek, screening en beeldgestuurde behandeling.