Profilering van DNA replicatie Timing met behulp van de zebravis als een modelsysteem In Vivo
30 april 2018
Zebravis onlangs gewend waren als een modelsysteem in vivo DNA replicatie timing tijdens ontwikkeling bestuderen. Hier is gedetailleerde de protocollen voor het gebruik van embryo's de zebravis profiel replicatie timing. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast om te bestuderen van replicatie timing mutanten, individuele celtypes, ziekte modellen en andere soorten.
Het algemene doel van deze procedure is om hele genoom DNA replicatie timing kaarten te genereren van zebravis embryo's in verschillende ontwikkelingsstadia. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de vakgebieden celcyclus en chromatine biologie, zoals hoe veranderingen in chromatine die plaatsvinden tijdens embryonale ontwikkeling de initiatie van DNA replicatiefokken kunnen beïnvloeden. Het grote voordeel van deze techniek is dat het replicatieveranderingen in kaart brengt die in vivo plaatsvinden in gedefinieerde stadia van embryonale ontwikkeling.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in hoe DNA replicatie verandert tijdens de ontwikkeling van de zebravis, kan deze ook worden toegepast op andere systemen of modelorganismen, zoals tunicaten, kikkers en vliegen. Over het algemeen kunnen mensen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat het enige oefening vereist om enkele cel suspensies te genereren uit zebravis embryo's. Plaats de avond voordat de embryo's worden verzameld tientallen volwassenen in broedtanks, met ongeveer gelijke aantallen mannetjes en vrouwtjes.
Afhankelijk van het experiment, gebruik een van de volgende broedstrategieën. Voor de eerste broedstrategie, plaats een paar mannetjes en vrouwtjes zebravis in individuele broedtanks, en gebruik een verdeler om de mannetjes van de vrouwtjes te scheiden. Als deze aanpak wordt gebruikt, zet dan veel verschillende broedtanks op en pool de embryo's van elk om ervoor te zorgen dat de biologische variabiliteit representatief is voor de populatie.
Voor broedstrategie nummer twee, combineer tientallen mannetjes en vrouwtjes zebravis in een grote broedtank. Gebruik deze strategie zolang er een voldoende groot aantal embryo's is. Het is redelijk om aan te nemen dat ze van een verscheidenheid aan oprichters komen en daarom genetisch representatief zijn voor de populatie.
Om getimede paringen uit te voeren, begin zodra de lichtcycli 's ochtends beginnen. Laat de vissen broeden in ondiep water gedurende een periode van 10 minuten, met een valse bodem voor embryo's om door te ontsnappen. Na 10 minuten, verzamel embryo's door ze door een zeef te gieten en gebruik een wasfles om ze in een 10-centimeter plaat te spoelen.
Pool alle embryo's die op hetzelfde tijdstip worden verzameld, markeer ze met het tijdstip van verzameling en plaats ze onmiddellijk in een incubator op 28,5 graden Celsius. Om ervoor te zorgen dat synchrone ontwikkelende embryo's worden verzameld, is het van cruciaal belang dat batches van embryo's elke 10 minuten worden verzameld. Dit is vooral belangrijk bij de vroegste stadia van embryonale ontwikkeling.
Honderden embryo's kunnen worden verwacht van een enkele paringspaar in een dag. Laat volwassenen broeden in cycli van 10 minuten totdat het aantal verkregen embryo's minder dan 20 is. Ongeveer een tot 1,5 uur na verzameling, om embryo's te sorteren, verwijder ze uit de incubator, observeer ze onder een disserpeermicroscoop en sorteer ze om dode en onbevruchte eieren te verwijderen.
Tel de embryo's, en plaats ze met een dichtheid van 100 embryo's per 10-centimeter plaat. Voeg vers E3 medium toe, en plaats de embryo's terug in de 28,5 graden Celsius incubator. Wanneer de embryo's het gewenste ontwikkelingsstadium bereiken, verifieer het stadium morfologisch onder een lichtmicroscoop volgens de Stadia van Embryonale Ontwikkeling van de Zebravis.
Als de embryo's 48 hpf of jonger zijn, breng tot 1500 gestageerde embryo's over naar een 15-milliliter conische buis en gebruik E3 om ze meerdere keren te wassen. Voeg voor elke 100 embryo's een milliliter E3 en 20 microliter Pronase oplossing toe en schudden voorzichtig. Tot 1500 embryo's kunnen in een enkele buis met 15 milliliter E3 worden gedechorioneerd. Leg de buis op zijn zij en rangschik embryo's in een gelijkmatige laag om een maximale oppervlakte-volume verhouding te garanderen.
Schud de buis zachtjes om de twee tot drie minuten totdat alle chorions van de embryo's zijn gevallen. De totale dechorionatietijd zal variëren afhankelijk van de Pronase activiteit. Verwijder het supernatant, en spoel de embryo's voorzichtig drie keer met 10 milliliter E3.
Nadat de embryo's op ijs zijn geplaatst en de resterende E3 is verwijderd, gebruik een milliliter vers bereide, ijskoude deyolking buffer voor elke 500 embryo's om het monster te wassen. Gebruik vervolgens een P1000 om de embryo's voorzichtig vijf tot tien keer op en neer te pipetten om de dooierzak te verstoren. Breng vervolgens een milliliter over naar een 1,5-milliliter microfugebuis en centrifugeer het monster bij vier graden Celsius en 500 keer zwaartekracht gedurende vijf minuten.
De monsters moeten net krachtig genoeg worden gepipetteerd om een enkele cel suspensie te creëren zonder de cellen te lyseren. Deze stap zal enige oefening vergen. Verwijder het supernatant en gebruik een milliliter ijskoud 1x PBS om de pellet te wassen om de Ringer's oplossing te verwijderen.
Centrifugeer vervolgens het monster opnieuw. Verwijder voorzichtig het supernatant en suspendeer de cellen in een milliliter 1x PBS. Plaats vervolgens de buis op ijs.
Voeg drie milliliter ijskoud ethanol toe aan een 15-milliliter conische buis en schudden voorzichtig de buis van EtOH op een lage instelling. Gebruik een P1000 om langzaam zebravis embryocel suspensie in de EtOH te druppelen terwijl doorgaan met schudden. Voeg een totaal van een milliliter van de embryocel suspensie toe, voor een uiteindelijke fixatie oplossing van 75%EtOH.
Nadat een milliliter celsuspensie is toegevoegd, schudden voorzichtig de buis om te mengen en plaats deze op zijn zij op min 20 graden Celsius gedurende ten minste een uur, of bewaar de suspensie in de vriezer gedurende twee tot drie weken. Om embryonaal DNA te kleuren, centrifugeer na het verwijderen van EtOH-gefixeerde embryocellen van min 20 graden Celsius de buis bij 1500 keer zwaartekracht en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Plaats de buis op ijs en verwijder voorzichtig het supernatant.
Vervolgens, gebruik een P1000 om cellen voorzichtig te suspenderen in een m
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor het genereren van timingkaarten voor DNA-replicatie van het volledige genoom uit zebravisembryo's in verschillende ontwikkelingsstadia. De methode biedt inzicht in chromatineveranderingen tijdens de embryonale ontwikkeling en de impact hiervan op de initiatie van de DNA-replicatie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celcyclus
- Chromatinebiologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Zebravissen dienen als in vivo model voor het bestuderen van de timing van DNA-replicatie.
- De techniek brengt replicatieveranderingen in kaart bij gedefinieerde embryonale stadia.
- De verkregen inzichten kunnen worden toegepast op andere modelorganismen.
- Er zijn uitdagingen verbonden aan het genereren van enkelcel-suspensies uit embryo's.
Doel van de studie
- Om de timing van DNA-replicatie tijdens de ontwikkeling van zebravis in kaart te brengen.
- Om te begrijpen hoe veranderingen in chromatine de initiatie van DNA-replicatie beïnvloeden.
- Om een protocol te bieden dat aanpasbaar is voor het bestuderen van diverse mutanten en ziektemodellen.
Gebruikte methoden
- Verzameling van zebravisembryo's in verschillende ontwikkelingsstadia.
- Genereren van timingkaarten voor replicatie van het volledige genoom-DNA.
- Toepassing van de methode op andere soorten, zoals tunicaten en kikkers.
- Ervaring met het maken van enkelcellige suspensies is vereist.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle mapping van de timing van DNA-replicatie in zebravissenembryo's.
- Demonstratie van chromatineveranderingen tijdens de embryonale ontwikkeling.
- Inzichten die toepasbaar zijn op andere modelorganismen.
- Verfijning van het protocol voor een eenvoudiger gebruik door onderzoekers.
Conclusies
- De methode biedt een waardevol instrument voor het bestuderen van de dynamiek van DNA-replicatie.
- De resultaten verbeteren het begrip van de chromatinbiologie tijdens de ontwikkeling.
- Potentieel voor bredere toepassingen in diverse biologische onderzoeksvelden.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Het begrijpen van de dynamiek van de DNA-replicatietiming biedt mechanistische inzichten in de chromatineregulatie en genomische stabiliteit, die cruciaal zijn voor doelwitvalidatie in het onderzoek naar oncologie en ontwikkelingsstoornissen. Het in vivo-model van de zebravis maakt timingprofilering van replicatie met een hoge resolutie en stadiumspecifiek mogelijk, wat het voorspellend vertrouwen in vroege ontdekkingen ondersteunt door chromatinarchitectuur te koppelen aan de start van de replicatie. Deze aanpak faciliteert het biologische risicobeheer van therapeutische hypothesen door te onthullen hoe ontwikkelingsstoornissen de replicatiepatronen in het gehele genoom beïnvloeden.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken door veranderingen in de replicatietiming tijdens de embryonale ontwikkeling in kaart te brengen, waardoor de relaties tussen chromatine en replicatie worden verduidelijkt.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbaar in vivo-systeem voor functionele targetvalidatie, waardoor mechanistische ambiguïteit in vroege stadia van programma's wordt verminderd.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de triage van portfolio's door het identificeren van wijzigingen in de replicatietiming die geassocieerd zijn met ziektemodellen of mutante lijnen, wat bijdraagt aan go/no-go-beslissingen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve, genoombrede profielen van de replicatietiming die dienen als gestandaardiseerde biomarkers voor de chromatinestatus en replicatiegetrouwheid.
- Operationele waarde: Levert genormaliseerde, uitgevlakte data-outputs die geschikt zijn voor high-throughput screening en vergelijking tussen verschillende condities bij de ontwikkeling van assays.
- Schaalbaarheid: Maakt de bereiding van enkelcel-suspensies uit embryo's in verschillende stadia mogelijk, wat schaalbare monstervoorbereiding ondersteunt voor downstream sequencing-applicaties.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de evaluatie van veranderingen in de timing van replicatie in ziektemodellen of verstoorde systemen, wat aansluit bij de translationele ontdekking van biomarkers bij kanker en ontwikkelingsstoornissen.
- Operationele waarde: Garandeert continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door het leveren van fase-opgeloste, in vivo gegevens over de timing van replicatie die toepasbaar zijn op genetische of omgevingsgebonden verstoringen.
- Risicobeperking: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door te onthullen hoe verstoringen in de timing van replicatie de ontwikkeling en ziektefenotypes beïnvloeden.
Integratie van pijplijn en workflow
De methode is geïntegreerd in het discovery-continuüm, van vroege toetsing van target-hypothesen tot preklinische validatie, en biedt een reproduceerbare in vivo readout van replicatiedynamiek die bijdraagt aan mechanische risicoreductie en assay-gereedheid.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten en pathway-verduidelijking door chromatinewijzigingen tijdens de ontwikkeling te koppelen aan gebeurtenissen bij de initiatie van DNA-replicatie.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk via gestandaardiseerde, kwantitatieve profielen van de replicatietiming, afgeleid van gesorteerde embryonale cellen in gedefinieerde ontwikkelingsstadia.
- Analytica: Biedt genormaliseerde read-counts, afgevlakte profielen van de replicatietiming en genoombrede correlatiemetrieken die kwantitatieve vergelijking van condities en replicaten mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit door beoordeling mogelijk te maken van veranderingen in de replicatietiming in ziekterelevante systemen, zoals mutante lijnen of ziektemodellen.
- Enterprise-hergebruik: Vestigt een herbruikbare capaciteit voor het profileren van de replicatietiming over genetische achtergronden, ontwikkelingsstadia en omgevingsperturbaties, ter ondersteuning van platformgebaseerde ontdekkingen.
Operationele en ondernemingsbrede impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in target-validatie door onzekerheid in de mechanistische verbanden tussen chromatine en replicatie te verminderen.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare workflows voor single-cell preparatie en het in kaart brengen van de replicatietiming, wat de consistentie tussen laboratoria verbetert.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege detectie van risico's geassocieerd met de replicatietiming mogelijk te maken, waardoor uitval in een laat stadium van discovery-programma's wordt verminderd.
- Impact op de portfolio: Informeert de risico-gecorrigeerde prioritering door verbindingen of genetische perturbaties te identificeren die de profielen van de replicatietiming in vivo veranderen.
Overwegingen voor implementatie
- Expertise in zebrafish-embryologie en ontwikkelingsstadia is vereist voor gesynchroniseerde embryo-collectie en morfologische verificatie.
- De instrumentatie omvat celsetters die in staat zijn tot propidiumjodide-detectie en een infrastructuur voor next-generation sequencing voor genoombrede kopie-aantalanalyse.
- Standaardisatie tussen teams is afhankelijk van consistente intervallen voor de embryo-collectie, dechorioneringsprotocollen en technieken voor het genereren van single-cell suspensies.
- Aanpassing aan mutantlijnen of ziektemodellen vereist validatie van de ontwikkelingstijd en de cellulaire opbrengst onder verstoorde condities.
- Praktische beperkingen omvatten de technische uitdaging om hoogwaardige single-cell suspensies uit embryo's te genereren, waarvoor oefening nodig is om cellyse tijdens de dissociatie te voorkomen.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Chapters in this video
0:05
Title
1:01
Setting Up Adult Zebrafish for Breeding
2:01
Timed Matings - Collecting, Sorting, and Housing Zebrafish Embryos for Experiments
3:23
Dechorionate, Deyolk, and Fix Zebrafish Embryos
6:09
Staining DNA and FACS Sorting Embryos
8:00
Results: Genome-wide DNA Replication Timing at High-resolution in Zebrafish
9:28
Conclusion
