Kwantificering van lipide overvloed en evaluatie van de distributie van het lipide in Caenorhabditis elegans door Nile rood en olie Red O kleuring

Het algemene doel van deze kleurmethoden is om de intracellulaire lipidenaanwezigheid te kwantificeren en de lipidenverdeling tussen verschillende weefsels te evalueren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het lipidenmetabolisme, zoals hoe lipiden genetisch en biochemisch worden gereguleerd en welke ziektetoestanden de lipidenhomeostase reguleren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het relatief eenvoudig en goedkoop is om uit te voeren.

Om Nile Red lipidenkleuring uit te voeren, plaats wormen op Nematode Growth Medium of NGM gezaaid met late log OP50 E.coli en laat de wormen groeien bij 20 graden Celsius tot de vroege L4-fase. Was de wormen met een millimeter PBST-oplossing en breng de wormensuspensie over naar een 1,5 milliliter microfugebuis. Centrifugeer de wormen bij 560 maal de zwaartekracht gedurende één minuut.

Verwijder vervolgens het supernatant en herhaal de PBST-wash totdat de E.coli uit de suspensie is verdwenen. Voeg vervolgens aan de wormenpellet 100 microliter 40% isopropanol of 60% voor ORO-kleuring toe en incubeer het monster gedurende drie minuten op kamertemperatuur. De toevoeging van isopropanol is cruciaal voor de juiste permeabilisatie van de wormen vóór het kleuren.

Centrifugeer de wormen bij 560 maal de zwaartekracht gedurende één minuut en verwijder het supernatant zonder de wormenpellet te verstoren. Het is belangrijk om lichtblootstelling tijdens de centrifugeringsstappen tot een minimum te beperken. Voeg nu, terwijl in het donker, 600 microliter van de eerder bereide NR-werkoplossing toe aan elk monster.

Keer de buisjes drie keer om en meng de wormen en de oplossing volledig. Bewaar vervolgens het monster in het donker bij kamertemperatuur gedurende twee uur. Na incubatie, centrifugeer de wormen en verwijder het supernatant.

Voeg vervolgens 600 microliter PBST toe en bewaar de monsters in het donker gedurende 30 minuten om de overtollige NR-kleurstof te verwijderen. Na het opnieuw draaien van de monsters zoals eerder, verwijder al het overtollige behalve ongeveer 50 microliter supernatant en suspendeer de wormenpellet in de resterende oplossing. Om dia's voor beeldvorming voor te bereiden, pipet 5 microliter wormensuspensie op een microscoopglaasje en breng voorzichtig een dekglas aan om luchtbellen te voorkomen.

Gebruik de FITC GFP-kanaal om NR-gekleurde wormen te beeld en probeer verschillende belichtingstijden, beeld de wormen af bij vijfvoudige vergroting om verschillende dieren per gezichtsveld te vangen. Schakel vervolgens over naar tienvoudige vergroting voor een betere kwantificering van individuele wormen. Om de afbeeldingen te kwantificeren, upload de micrografieën naar ImageJ.

In het afbeeldingsmenu, pas de helderheid en het contrast van het afbeeldingsdek aan en breng wijzigingen door op alle afbeeldingen door op toepassen te klikken. Gebruik het polygoonselectiegereedschap om elke afgebeelde worm af te bakenen en gebruik onder het analysemenu de meetfunctie om de fluorescentie-intensiteit die door NR wordt uitgezonden te kwalificeren. Meet voor elke afbeelding vijf achtergrondlocaties en bereken de gemiddelde achtergrondfluorescentie-intensiteit. Voeg 600 microliter Oil Red O of ORO-werkoplossing toe aan elk monster en draai de buis drie keer om om de wormen goed en de ORO te mengen.

Roteer de monsters bij 30 RPM en RT gedurende twee uur. Centrifugeer de monsters bij 560 maal de zwaartekracht gedurende één minuut en zuig al het supernatant op, behalve 100 microliter. Gebruik vervolgens 600 microliter PBST om de monsters te resuspenderen en draai de buisjes gedurende 30 minuten bij 30 RPM om overtollige ORO-kleuring te verwijderen.

Om de locatie van de geslachtslijn van de dieren in de darmcellen beter te onderscheiden, kleurt u de kernen door een microliter DAPI toe te voegen voor elke milliliter ORO-werkoplossing. Om dia's voor beeldvorming voor te bereiden, resuspendeer de wormen en het resterende supernatant en meng de oplossing goed. Breng vijf microliter wormensuspensie op een microscoopglaasje en breng voorzichtig een dekglas aan om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen ontstaan.

Gebruik voor het beeld van de ORO-gekleurde wormen een kleurcapaciteit camera bij vijfvoudige vergroting om verschillende wormen in één gezichtsveld af te beelden. Schakel vervolgens over naar tienvoudige vergroting voor een betere onderzoek van individuele wormen. Categoriseer ten slotte de afbeeldingen volgens de lipideaccumulatie in het hele lichaam van het dier of in specifieke weefsels na het uploaden van de afbeeldingen naar ImageJ en het maken van een afbeeldingsdek volgens het tekstprotocol.

SKN-1 vertoont homologie met zoogdier Nrf2 en is aangetoond dat het vetzuuroxidatie mediëren. Deze figuur toont geactiveerde SKN-1-dieren die worden blootgesteld aan omstandigheden die leiden tot toenemende lipideniveaus. Zoals te zien in deze afbeeldingen, is de NR-fluorescentie die met behulp van het FITC GFP-kanaal wordt vastgelegd, prominent langs de darm, maar is het dimmer in het hoofd, de staart en het darmlumen.

Hoewel het gemakkelijk is om de wormen te categoriseren op basis van de aanwezigheid of afwezigheid van leeftijdsafhankelijke somatische afbraak van vet of ASDF, kan het moeilijk zijn om dieren met een gemiddelde vetverlies te identificeren. In vergelijking met niet-ASDF-dieren, die helderrode kleuring over het hele lichaam vertonen met weinig doorschijnende gebieden, vertonen ASDF-wormen merkbare vetafbraak in darmcellen. Dieren in het proces van het ontwikkelen van ASDF vertonen vaak doorschijnende vlekken waar de meeste vetverliezen uiteindelijk optreden.

Bovendien kunnen ASDF-wormen nog steeds helderrode kleuring in de hoofd- en staartregio's vertonen omdat het fenotype niet wordt gedefinieerd door volledige somatische vetverlies, maar door uitgebreide vetafbraak ten opzichte van niet-geïrriteerde dieren. E