Isolatie, karakterisering en High Throughput extracellulaire Flux-analyse van muis primaire renale tubulaire epitheliale cellen
20 juni 2018
Dit protocol biedt een rendabele aanpak om te isoleren en karakteriseren van muis primaire renale tubulaire cellen die vervolgens sub kunnen worden gekweekt om te beoordelen renale biologische functies- ex vivo, met inbegrip van de mitochondriale Bioenergetica.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen over niermetabolisme, zoals oxidatie van vetzuren, die nauw verbonden is met de ontwikkeling van renale fibrose en verschillende andere nefropathieën. Het grote voordeel van deze techniek is het gebruik van een high-throughput platform om stoffen te screenen die de mitochondriale bio-energetica in renale tubulaire epitheelcellen reguleren. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar de therapie van niermetabole ziekten omdat het een hoogwaardige screening van stoffen mogelijk maakt die de mitochondriale stofwisseling in nierepitheelcellen reguleren.
Om de met collageen beklede 60-millimeter Petri-schalen voor te bereiden, voegt u twee milliliter van een vooraf gefilterde 20-millimolaire azijnzuur toe, gevolgd door 35 microliter collageen I-oplossing in elke schaal. Bewaar de plaat vervolgens een uur op kamertemperatuur, laat hem drogen en stel hem bloot aan UV. Was vervolgens de azijnzuurresten af met PBS. Voer drie spoelbeurten uit.
Bewaar de schaal vervolgens in een koolstofdioxidevrije celkweekincubator op 37 graden Celsius. Nadat de muis klaar is voor de operatie, verwijdert u het haar van de borst en buik met een ontharingscrème. Desinfecteer vervolgens de huid met jodium en veeg de jodiumresten weg.
Maak vervolgens een incisie om de buikholte te openen en leg het hart en de nieren bloot. Stel nu een perfusiepomp in op 32 milliliter per minuut en verwijder eventuele luchtbellen in de slang voordat u met de perfusie begint. Gebruik een 27-gauge naald aan het einde van de lijn.
Om door te gaan, steekt u een naald door het hart via de hartspits in de linker ventrikel. Zodra de buffer het hart vult, maakt u een gat in het rechter atrium om een uitlaat voor de perfusiebuffer te creëren. Schakel vervolgens over naar de verteringsbuffer en verlaag de pompsnelheid iets tot 30 milliliter per minuut voor de vertering.
Nadat 20 milliliter verteringsbuffer is geperfundeerd, verwijdert u beide nieren voor de isolatie van de tubulaire cellen. Om de geoogste nieren te verwerken, verwijdert u eerst de nierschalen en merg. Snijd vervolgens beide nieren in kleine stukjes en incubeer ze in 10 milliliter verteringsbuffer in een oven van 37 graden Celsius met zacht draaien gedurende vijf minuten.
Na de vertering verwijdert u eventueel onverteerd weefsel door de buffer door een 70-micronfilter te laten lopen. Nadat u het verteerde weefsel hebt verzameld, voegt u 10 milliliter kweekmedium toe om de vertering te stoppen. Centrifugeer vervolgens de gefilterde weefselsuspensie bij 50 g gedurende vijf minuten om de tubulaire cellen te pellen.
Breng vervolgens het supernatant over in een nieuwe buis, voeg vijf milliliter kweekmedium toe en herhaal de centrifugatie om eventuele resterende tubulaire cellen te verzamelen. Herstel het eerste pellet op in 20 milliliter kweekmedium en centrifugeer het bij 50 g gedurende vijf minuten om de verzamelde cellen verder te zuiveren. Gooi het supernatant weg.
Breng vervolgens beide pellets op in 10 milliliter kweekmedium. Tel vervolgens de levende cellen met behulp van trypanblauwkleuring. Zaai vervolgens maximaal 10 miljoen cellen op een 60-millimeter met collageen beklede schaal en laat de tubulaire cellen een nacht lang hechten.
Voor het begin zaait u P1-tubulaire cellen in aantallen van 40.000 in de putjes van een vers bereide 96-well microplaat bekleed met collageen. Gebruik 100 microliter kweekmedium per putje. Optimalisatie van celdichtheid en stofconcentratie in de extracellulaire flux assay is cruciaal voor een succesvol experiment.
We raden een piloot titratie-experiment aan om de optimale celdichtheid en stofconcentratie te identificeren. Hydrateer vervolgens de sensorcartridge. Til eerst de sensorcartridge op en vul elk putje van de plaat met 200 microliter kalibratie-oplossing.
Plaats vervolgens de cartridge opnieuw om de sensoren onder te dompelen en incubeer de assemblage een nacht bij 37 graden Celsius. De volgende dag zuigt u het oude medium af en vervangt u het door 175 microliter glucose- of vetzuuranalysemedium. Gaat u dan door met incuberen gedurende een uur zonder koolstofdioxide.
Tijdens de celincubatie laadt u poort A van de cartridge met 25 microliter oligomycine, poort B met FCCP, poort C met rotenon/antimycin A en laadt u poort D en alle andere poorten met water. Bewaar de cartridge vervolgens in de koolstofdioxidevrije incubator totdat de setup klaar is voor kalibratie. Ga verder door de extracellulaire flux-analyzer en de controller in te schakelen.
Open vervolgens de Analyzer Software, kies een standaardtest en druk op de Assay Wizard-optie. Kies vervolgens onder het tabblad Compounds de verbindingen toe aan de juiste poorten. Kies onder het tabblad Background Correction de putjes die geen cellen bevatten.
Gebruik vervolgens het tabblad Groups and Labels om de experimentele groepen te labelen. Stel vervolgens onder het tabblad Protocol de juiste mix- en meetcycli in met behulp van de beschikbare commando's. Deze instellingen worden aangegeven in het tekstprotocol en eenmaal ingevoerd, slaat u de sjabloon op voor toekomstig gebruik.
Druk nu op End Wizard om door te gaan. Druk nu op Start om met de kalibratie te beginnen. De analyzer werpt vervolgens de plaathouder uit en vraagt om de cartridgeplaat te plaatsen.
Dit kalibratieproces duurt 20 tot 25 minuten om te voltooien. Zodra het systeem is gekalibreerd, drukt u op de prompt-opdracht om de kalibratieplaat te verwisselen voor de celplaat en gaat u verder met de run. Wanneer de run is voltooid, slaat u de OCR-gegevens op en verwijdert u de plaat uit de analyzer.
Voeg nu Hoechst toe aan elk van de testputjes en incubeer de plaat gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Tel vervolgens de cellen met 355-nanometer excitatie en 460-nanometer emissie, en normaliseer de OCR-gegevens op het aantal cellen. In dit protocol werd een heterogene populatie niercellen, onvolledig verteerde tubuli en ander weefselafwisselend op met collageen beklede platen gekweekt.
De dag na isolatie werd het k
Overzicht
Dit protocol biedt een kosteneffectieve benadering voor het isoleren en karakteriseren van primaire renale tubuluscellen van muizen, die vervolgens kunnen worden gesubcultured om renale biologische functies ex vivo te beoordelen, inclusief mitochondriële bioenergetica.
Belangrijkste Componenten van de Studie
Wetenschappelijk gebied
- Nefrologie
- Celbiologie
- Metabool onderzoek
Achtergrond
- Deze methode beantwoordt belangrijke vragen over het renale metabolisme.
- De focus ligt op vetzuuroxidatie in relatie tot renale fibrose en nefropathieën.
- De techniek maakt high-throughput screening van verbindingen mogelijk.
- Dit is van groot belang voor de therapie bij renale metabole ziekten.
Doel van de studie
- Om renale tubuluscellen te isoleren en te karakteriseren.
- Om de mitochondriale bioenergetica in deze cellen te beoordelen.
- Om high-throughput screening mogelijk te maken van verbindingen die het renale metabolisme beïnvloeden.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van collageen-gecoate schaaltjes voor celkweek.
- Chirurgische isolatie van muisnier voor extractie van tubulaire cellen.
- Gebruik van digestiebuffers en centrifugatie voor celzuivering.
- Extracellulaire fluxanalyse om de mitochondriële functie te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie en cultuur van renale tubuluscellen.
- De cellen bereikten binnen vijf dagen een confluentie van 80-90%.
- High-throughput screening mogelijk gemaakt voor verbindingen die het mitochondriële metabolisme beïnvloeden.
- Het protocol maakt reproduceerbare resultaten mogelijk in studies naar renale cellen.
Conclusies
- Het protocol is effectief voor het bestuderen van functies van renale tubuluscellen.
- Het biedt inzichten in het renale metabolisme en potentiële therapieën.
- High-throughput-mogelijkheden verhogen de efficiëntie van het onderzoek.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
High-throughput analyse van de extracellulaire flux in primaire renale tubulaire epitheelcellen van muizen maakt een robuuste onderzoeken van de mitochondriale bioenergetica mogelijk, een kritieke determinant in de pathogenese van nierziekten. Deze workflow ondersteunt vroege targetvalidatie en mechanische risicoreductie voor metabole pathways die betrokken zijn bij chronische nierziekte. De schaalbaarheid en reproduceerbaarheid van het protocol maken het tot een fundamentele capaciteit voor drug discovery-portefeuilles die gericht zijn op het renale metabolisme.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe beoordeling van de mitochondriale functie in ziekterelevaante renale celpopulaties mogelijk.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door kwantificering van vetzuuroxidatie en metabolische flux.
- Faciliteert functionele targetvalidatie voor pathways die gekoppeld zijn aan renale fibrose en nefropathieën.
- Biedt voorspellende zekerheid voor het verder ontwikkelen van metabole targets in pijplijnen voor renale ziekten.
Screening & assayontwikkeling
- Biedt gestandaardiseerde high-throughput screening van verbindingen die de mitochondriale bioenergetica beïnvloeden.
- Optimaliseert assay-condities voor celldichtheid en verbindingconcentratie, wat de reproduceerbaarheid waarborgt.
- Genereert kwantitatieve outputs (OCR) voor een betrouwbare evaluatie en vergelijking van verbindingen.
- Maakt hergebruik van het platform mogelijk voor iteratieve screenings- en lead-optimalisatiecycli.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt ex vivo metabole read-outs uit met ziekterelevante niercelmodellen.
- Ondersteunt de ontwikkeling van translationele biomarkers door mitochondriële functie te koppelen aan renale pathologie.
- Biedt continuïteit vanaf de vroege ontdekkingsfase tot aan de preklinische validatie van metabole interventies.
- Vermindert het biologische risico door functionele beoordeling mogelijk te maken voorafgaand aan in vivo studies.
Integratie van pipeline en workflow
Dit protocol integreert het proces van vroege ontdekking tot lead-identificatie en ondersteunt zowel target-validatie als compound-screening in onderzoek naar het renale metabolisme.
- Ontdekkingsbiologie: Kwantificeert mitochondriale respiratie en vetzuuroxidatie om de betrokkenheid van metabole routes bij nierziekten te verduidelijken.
- Screening: Biedt high-throughput, reproduceerbare assaycondities voor de evaluatie van verbindingen in primaire niercellen.
- Analytica: Levert genormaliseerde OCR-metingen voor een robuuste statistische vergelijking tussen experimentele groepen.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen ex vivo metabole bevindingen en preklinische modellen van chronische nierziekte.
- Bedrijfswijde hergebruik: Vestigt een schaalbare, gestandaardiseerde workflow voor lopend onderzoek naar niermetabolisme en screeningscampagnes.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de selectie en validatie van metabole targets.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en doorvoersnelheid in assays met renale cellen.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go-besluitvorming en vermindert het biologische risico in een laat stadium bij de ontdekking van renale geneesmiddelen.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering mogelijk van metabole targets en verbindingen voor renale indicaties.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de isolatie van primaire cellen en mitochondriale functionele assays.
- Toegang tot high-throughput extracellular flux analyzers en compatibele software is noodzakelijk.
- Strikte standaardisatie van de celdichtheid en verbindingconcentraties is vereist voor reproduceerbaarheid.
- Aanpassingen kunnen nodig zijn voor andere soorten of renale cel-subtypes.
- Zorgvuldige monitoring van assay-variabelen is essentieel om experimentele fouten te voorkomen.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Chapters in this video
0:04
Title
0:50
Preparing Collagen I Plates
1:31
Perfusion, Digestion and Harvesting Kidneys from Mice
2:36
Tissue Processing and Primary Tubular Cells Isolation
4:11
Mitochondria Bioenergetics Assay
7:26
Results: Renal Tubular Epithelial Cell (TEC) Morphology and Metabolism
9:04
Conclusion
