Optimalisatie van Laser-Capture Microdissection voor de isolatie van darmen Ganglia van menselijk weefsel vers bevroren

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over het enterische zenuwstelsel, zoals het expressieprofiel van enterische ganglia in de darmen van volwassen mensen. Het grootste voordeel van deze techniek is dat het kan worden gebruikt om hoge opbrengsten van RNA uit humane enterische ganglia te verkrijgen met maximale behoud van de RNA-kwaliteit. Begin met darmweefsel gesneden in lengtes van 20 centimeter.

Verwijder eerst het vetweefsel en bindweefsel. Vermijd het snijden van de serosa, wat kan leiden tot structurele schade aan het myenterische plexus. Maak vervolgens een longitudinale incisie over de hele lengte van het bijgesneden monster, bij voorkeur op de plaats van bevestiging van de mesenteria.

Vervolgens worden de taeniae coli uit de dikke darm verwijderd en weggegooid, zodat het weefsel zich kan vlakken. Spreid nu de darm uit, mucosa zijde naar beneden, op een gekoelde snijplank. Snijd vervolgens 1,25 centimeter brede stroken over de volledige lengte van het weefsel.

Breng elk stuk over in een gekoelde weefselopslagoplossing voor tijdelijke opslag. Snijd vervolgens elke strook in segmenten van twee tot 1,5 centimeter lang. Nadat een strook in segmenten is gesneden, dep de segmenten droog.

Het is belangrijk dat het weefsel erg droog is, zodat er geen ijskristallen op het weefsel ontstaan wanneer het wordt bevroren. Schik nu de gedroogd weefsel, mucosa zijde omhoog, op een koude, wegwerpbare plastic mal. Vervolgens vlakt u elk stuk af met gebogen pincetten om opgesloten luchtbellen te verwijderen.

Het weefsel zal uitzetten terwijl het wordt vlakgemaakt. Beoordeel de dikte van de weefselsegmenten na het vlakmaken voor het invriezen. Duw indien nodig de randen van het monster naar binnen totdat het darmmonster de oorspronkelijke dikte benadert.

Breng nu de geladen basismal naar een slurry van droog ijs en 2-methylbutaan. Het weefsel moet binnen 30 tot 60 seconden volledig bevriezen. Droog vervolgens onmiddellijk de bodem van de mal met koude doekjes die op droog ijs zijn bewaard.

Controleer nu het monster. Let op eventuele monsters die er niet plat uitzien. Wikkel vervolgens de mal in aluminiumfolie die vooraf is gelabeld en gekoeld voor gebruik.

Bedek vervolgens de folie met een laag plasticfolie om uitdroging tot een minimum te beperken. Houd de monsters op ijs totdat ze kunnen worden bewaard bij min 80 graden Celsius. Nadat u de benodigde materialen hebt voorbereid, giet u een 3 tot 5 millimeter bergje TFM op een grote cryostaat monsterhouder en brengt u het darmmonster onmiddellijk over, serosa zijde omhoog, op de TFM.

Na enkele seconden op kamertemperatuur, brengt u de monsterhouder over naar droog ijs en bedekt u deze met poedervormig droog ijs. Zorg ervoor dat de TFM vóór het snijden onder het vlak van het myenterische plexus ligt. Monteer vervolgens de monsterhouder in de cryostaat monsterkop en lijn het monster uit met de cryostaatmes.

Maak het vlak van het myenterische plexus evenwijdig aan het snijmes. Maak nu acht micronseringen door de serosa en longitudinale spier totdat u het myenterische plexus bereikt. Om het myenterische plexus te lokaliseren, monteert u een monster en kleurt u het met een waterige kleurstof, zoals 1% kristallen violet.

Om verder te gaan, identificeert u de overgang tussen de longitudinale en circulaire spierlagen. Bij het begin van de sectie zal de serosa worden gemarkeerd door de aanwezigheid van bindweefsel. Er kan ook nog wat mesenterisch vet aanwezig zijn langs de serosa.

Vervolgens wordt de laag van de buitenste longitudinale spier zichtbaar. Zodra de grens tussen de longitudinale en circulaire spierlagen is bereikt, zal een deel van de enterische ganglia worden waargenomen. In de volgende secties zal het myenterische plexus zeer duidelijk worden met grote gebieden van ganglia in een enkele sectie. Verzamel nu seriële secties voor de laser-capture microdissectie.

Koel PEN-schuiven in de cryostaat gedurende vijf tot 10 seconden en gebruik ze om de secties te monteren. De beste secties zullen veel neuronen en gliacellen bevatten. Ga vervolgens verder met het kleuren en vervolgens dehydrateren van de secties zoals beschreven in het tekstprotocol.

Voorbereiding: plaats een cartridge met LCM-doppen in de LCM-microscoopstandaard. Laad vervolgens de monsterschuif op de standaard en verwerf een overzichtsafbeelding van de dia. Identificeer de gewenste locatie voor LCM en laad een dop op de dia.

Richt vervolgens de infraroodlaser uit en pas het vermogen en de duur van de laser aan voor een opvangstip van 20 tot 30 micron in diameter. Omcirkel vervolgens de gewenste ganglia die moeten worden verzameld. Zorg ervoor dat u binnen de grenzen van het verzamelbare gebied op de dop blijft, dat als een groene cirkel wordt weergegeven.

Voor elk van de met een UV-snijsporing omlijnde ganglia, pas de IR-spots aan zodat er ten minste één IR-spot elke 100 tot 500 micron is om ervoor te zorgen dat alle ganglia worden verzameld wanneer de dop van het monster wordt getild. Druk vervolgens op de IR UV Cut knop om door te gaan met het verzamelen van alle gemarkeerde ganglia. Nadat het verzamelen is voltooid, verplaatst u de dop naar een nieuwe locatie en herhaalt u het verzamelproces.

Dit kan gedurende 60 tot 80 minuten worden herhaald. Wanneer de LCM-dop is geladen met voldoende ganglia, brengt u deze over naar een kwaliteitscontrolestation. Als er puin op de dop aanwezig is, veegt u dit weg met een fijne penseeltip die is voorbereid voor RNA-gebruik.

Gebruik een pipettentip voor eventueel moeilijk te verwijderen puin. Bevestig vervolgens de dop op een 0,5 milliliter microcentrifugebuisje gevuld met 230 microliter RNA-lysebuffer. Draai de dop om, vortex kort en incubeer vervolgens het monster op kamertemperatuur gedurende 30 minuten.

Centrifugeer vervolgens het monster gedurende vijf minuten bij 5.000 g of sneller en breng vervolgens het microcentrifugebuisje over naar droog ijs. Het monster is nu klaar voor de RNA-extract