Bepaling van het plasmamembraan partitioneren voor zijdelings-geassocieerde eiwitten
15 juni 2018
Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van een kwantitatieve analyse van het niveau van de plasma-membraan vereniging voor fluorescently-tagged verbond-geassocieerde proteïne. De methode is gebaseerd op de computationele decompositie van membraan en cytoplasmatische onderdeel van signaal waargenomen in cellen die zijn gemarkeerd met plasmamembraan fluorescerende marker.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de celbiologie, inclusief het ontrafelen van celsignaleringsroutes. Dus het grote voordeel van deze techniek is dat het eigenlijk geen geavanceerde, microscopische benaderingen vereist. Het is ook erg snel en daarom bruikbaar voor realtime observatie van eiwitverdeling in cellen.
De evaluatie en kwantificering van membraanpartitie van perifeer geassocieerd eiwit is gecompliceerd vanwege lichtdiffractie die een mengen van plasmamembraan en cytoplasmatische fluorescentie veroorzaakt onder de microscoop. Begin deze procedure met de voorbereiding van biologisch materiaal zoals beschreven in het tekstprotocol. Kleur het voorbereide materiaal met FM 4-64 kleurstof door een kleurprotocol toe te passen dat geschikt is voor het bestudeerde materiaal.
Voor tabak BY-2 cellen, kleur 200 microliters celsuspensie met 0,2 microliters van 10 millimolair FM 4-64 oplossing in dimethylsulfoxide. Om één equatoriale confocale sectie per cel vast te leggen, stel een sequentieel twee-kanaals scannen in voor de chromofoor die als eiwitmarkering wordt gebruikt en voor FM 4-64. Stel ook een hogere optische resolutie in.
Een voorbeeldopstelling is een 63-voudige oliëmergingsobjectief met een numerieke opening van 1,3 en een beeldgrootte van 1.024 bij 1.024 pixels. Installeer Fiji ImageJ Distribution en de vereiste macrorandapparatuur. In Fiji, selecteer plugins, dan macros, dan install in het hoofdmenu en specificeer het pad naar het gedownloade bestand met de ImageJ macrorandapparatuur.
Installeer de R Project software en vereiste pakketten. Voer de R Graphical User Interface uit, selecteer pakketten, dan installeer pakketten in het hoofdmenu, en specificeer het dichtstbijzijnde repository evenals pakket ggplot2 voor installatie. Download het R-pakket randapparatuur.
Installeer ze door pakketten te selecteren en vervolgens pakketten van lokale bestanden te installeren. Verwerk de confocale beelden van de cytoplasmatische marker. Om dit te doen, importeer de beelden naar Fiji met behulp van plugins dan bioformats, dan bioformats importer uit het Fiji-menu met standaardinstellingen.
Voer de importopties macro uit voor een analyseopstelling. Activeer de macro door hetzelfde item te selecteren nadat u op het menu-item randapparatuur voor eiwitmenu hebt geklikt. Definieer de juiste waarde in het veld gaussian blur radius pixel.
Dit beïnvloedt de beeldslijping en ruisonderdrukking. Een lage waarde is voldoende en veroorzaakt geen verlies van beeldinformatie. Stel nu een waarde in het veld profiellijnbreedte pixel in.
Een dikkere lijn veroorzaakt een hogere gladheid van de profielcurven. Een standaardwaarde van 10 pixels wordt aanbevolen. Stel een beeldtitel in, geparseerd door de definitie van steekproefscheidingstekens en geëxporteerde items.
Klik op OK. Controleer het titelparsing in het volgende dialoogvenster en klik op OK of terug om opnieuw in te stellen. Voer vervolgens een lineaire selectie uit over de plasmamembraanregio in de verwerkte beelden en meet de fluorescentieprofielen. Om dit te doen, selecteer de Fiji-tool rechte lijn vanuit de Fiji-werkbalk.
Klik op het beeld en sleep een lijn over de plasmamembraanregio. De lijn moet beginnen in de extracellulaire ruimte en moet loodrecht staan op de plasmamembraan. Kies gebieden met een dikkere en meer homogene laag van kortekaal cytoplasma.
De optimale lengte van de lineaire selectie is vijf tot 10 micrometer. Voer de take profile macro uit door op de take profile tool in de Fiji-werkbalk te klikken. De automatische meting van fluorescentieprofielen in beide kanalen zal worden uitgevoerd en de gegevens worden weergegeven in het resultaatvenster.
Neem volgens individuele signaalvariabiliteit representatief aantallen profielen voor elke cel. Voer de plot profile data macro uit voor grafische visualisatie van de gemeten profielen. Stel de parameter in in het opgeroepen macrodialoogvenster.
Houd het selectievakje gebruik filtering voor invoergegevens niet geselecteerd. Geef aan of de plot moet worden gemaakt van recente gegevens in het resultatevenster uit een enkele CSV-bestand of uit alle CSV-bestanden in een opgegeven directory door op de juiste optiek te klikken. Geef aan welke groepeerfactoren zullen worden gebruikt voor het plotten door de juiste selectievakjes te selecteren.
Selecteer de factor I als alle profielen in unieke plots moeten worden weergegeven. Houd de selectievakjes niet geselecteerd als alle gegevens in één plot moeten worden weergegeven. Klik op OK. Specificeer het pad en bestandsnaam voor het opslaan van de resultaten of voor eventuele gegevensimport in het volgende dialoogvenster.
Bevestig de analyse door op OK te klikken in de dialoogvensters, die de uitgevoerde R-code toont. Voer de profile filtering setup macro uit als sommige uitgezette profielen overmatige signalen hebben in de extracellulaire of de intracellulaire ruimte. Volg door de parameters in het opgeroepen macrodialoogvenster in te stellen.
Stel voor elk kanaal de juiste intensiteitsdrempel in het bestand in, verwijder metingen met een overmatige extracellulaire of intracellulaire signaal. Geef het gebied op waar de intensiteitsdrempel zal worden toegepast in het veld bij X-coördinaten lager of groter dan en klik vervolgens op OK. Voer de plot profile data macro opnieuw uit met het selectievakje gebruik filtering voor gegevensinvoer geselecteerd. Voeg nu de gegevens toe van het eerder opgeslagen bestand.
Zorg ervoor dat alle afwijkende profielen met succes zijn verwijderd, anders verbeter de filterparameters. Voer de create model macro uit om een model te maken van de fluorescentieverdeling van de plasmamembraan en het cytoplasma op basis van de kalibratiegegevens. Nadat u de parameters in het opgeroepen macrodialoogvenster hebt ingesteld zoals beschreven in het tekstprotocol, klikt u op OK. Specificeer het invoerbestandspad en -naam in de volgende dialoogvensters en bevestig de analyse door op OK te klikken in het dialoogvenster dat de uitgevoerde R-code toont.
Verwerk vervolgens de beelden van de cellen die het eiwit van belang tot expressie brengen. Importeer de beelden en stel de analyse in zoals eerder. De slijpgraad en lijnbreedte moeten identiek zijn.
Ga verder met het meten van de profielen. Controleer de nauwkeurigheid van de profielen door te plotten en stel de filtering in indien gewenst zoals eerder beschreven. Voer de calculate distribution macro uit voor de berekening van een eiwitpartitie tussen de
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor de kwantitatieve analyse van de associatie met het plasmamembraan van fluorescentie-gelabelde perifeer geassocieerde eiwitten. De methode maakt real-time observatie van de eiwitdistributie mogelijk zonder dat hiervoor geavanceerde microscopie vereist is.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Fluorescentiemicroscopie
- Proteïneanalyse
Achtergrond
- Het begrijpen van cel-signaleringspaden is van cruciaal belang in de celbiologie.
- Lichtdiffractie bemoeilijkt de evaluatie van membraanpartitionering.
- Fluorescente markers worden gebruikt om de eiwitlokalisatie te visualiseren.
- Deze methode vereenvoudigt de analyse van de eiwitdistributie.
Doel van de studie
- Om een snel en efficiënt protocol te bieden voor het analyseren van eiwitlokalisatie.
- Om real-time observatie van eiwitdistributie in cellen mogelijk te maken.
- Om uitdagingen bij het kwantificeren van de membraanassociatie van eiwitten aan te pakken.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van biologisch materiaal volgens het protocol.
- Kleuring met FM 4-64 kleurstof.
- Computationele decompositie van fluorescentiesignalen.
- Real-time observatie van eiwitdistributie.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt een effectieve kwantificering van de membraanassociatie mogelijk.
- Realtime observaties bieden inzicht in de proteïnedynamiek.
- De uitdagingen van lichtdiffractie worden aangepakt via computationele methoden.
- Het protocol is toepasbaar op diverse biologische materialen.
Conclusies
- Dit protocol biedt een eenvoudige benadering om de lokalisatie van eiwitten te bestuderen.
- Het vergroot het begrip van cel-signaleringspaden.
- De methode is toegankelijk en vereist geen geavanceerde microscopie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Kwantitatieve bepaling van de plasmamebraanpartitie voor perifeer geassocieerde eiwitten maakt mechanistische risicoreductie mogelijk bij vroege ontdekking en targetvalidatie. Deze op microscopie gebaseerde workflow biedt een snelle, reproduceerbare kwantificering van de lokalisatiedynamiek van eiwitten, wat bijdraagt aan de voorspellende betrouwbaarheid bij het onderzoeken van signaalpaden en studies naar het werkingsmechanisme van verbindingen. De compatibiliteit van de methode met diverse celtypen en de integratie met opensource analytische tools positioneren deze als een herbruikbare capaciteit voor R&D over de gehele portfolio.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & target-validatie
- Maakt kwantitatieve beoordeling van eiwit-membraaninteracties mogelijk, wat essentieel is voor targetvalidatie.
- Ondersteunt mechanistische de-risking door onderscheid te maken tussen membraangeassocieerde en cytoplasmatische eiwitpools.
- Faciliteert de evaluatie van mutante eiwitten, inhibitor-effecten en verstoringen in signaleringspaden.
- Biedt snelle feedback voor hypothese-gestuurde target-triage.
Screening & Assayontwikkeling
- Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve fluorescentieprofielen voor de ontwikkeling van assays.
- Maakt reproduceerbare meting van subtiele en dynamische veranderingen in eiwitlokalisatie mogelijk.
- Ondersteunt het screenen van verbindingenbibliotheken op effecten op membraanassociatie.
- Maakt hergebruik van het platform mogelijk voor meerdere eiwitdoelen en cellsystemen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij translationele biomarkerstrategieën door veranderingen in eiwitlokalisatie als reactie op perturbaties te kwantificeren.
- Biedt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie voor membraangeassocieerde targets.
- Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk op basis van kwantitatieve lokalisatiegegevens.
Pipeline- & workflowintegratie
Deze methode integreert in het continuüm van ontdekking tot prekliniek door een gestandaardiseerde aanpak te bieden voor het kwantificeren van eiwitpartitionering bij het plasmamembraan, wat zowel mechanistische studies als screeningsworkflows ondersteunt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door de lokalisatie in het membraan versus het cytoplasma te kwantificeren.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten die geschikt zijn voor het screenen van verbindingen en mutanten.
- Analytics: Genereert fluorescentie-intensiteitsprofielen en statistische output voor een robuuste vergelijking van condities.
- Translationeel onderzoek: Maakt afstemming met biomarkerstrategieën mogelijk door dynamische veranderingen in lokalisatie te kwantificeren.
- Enterprise Reuse: Biedt een schaalbare open-source workflow die aanpasbaar is voor verschillende targets en celtypen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Standardiseert kwantificering en verbetert de reproduceerbaarheid tussen experimenten.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door het leveren van robuuste lokalisatiegegevens.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van membraangeassocieerde targets mogelijk.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in fluorescentiemicroscopie en kwantitatieve beeldanalyse.
- Toegang tot confocale beeldvormingsplatforms en computationele infrastructuur (ImageJ, R) is noodzakelijk.
- Vereist standaardisatie van beeldvormings- en analyseparameters over teams heen.
- Aanpasbaar aan verschillende celtypen met gladde, onderscheidbare plasmamembranen.
- Beperkt tot niet-naburige celmembranen en kan optimalisatie vereisen voor specifieke biologische contexten.
