Gedwongen speekselvloed als een methode voor het analyseren van Vector bevoegdheid van muggen
7 augustus 2018
Voor een efficiënte controle van mug virusverspreiding gedragen, is de kennis van het potentieel van de vector van respectieve muggen van bijzonder belang. Beschrijven we gedwongen speekselvloed als een methode voor het analyseren van vector bevoegdheid van Aedes albopictus en drie verschillende Culex taxa voordeoverdracht van Zika-virus.
Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van door muggen overgedragen ziekten te beantwoorden, zoals of een muggensoort een competente vector is voor een bepaald virus. Het grote voordeel van deze methode is dat een grote hoeveelheid muggen tegelijkertijd kan worden geanalyseerd, zonder het gebruik van laboratoriumdieren zoals muizen. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat het fijne motorische vaardigheden vereist die alleen via oefening kunnen worden verworven.
Visuele demonstratie van deze techniek is cruciaal, omdat de belangrijkste stappen moeilijk te leren zijn; ze vereisen ervaring met het hanteren van muggen en virussen, en ook fijne motorische vaardigheden. Om te beginnen, verdunt u de virusvoorraad. Meng vervolgens afgelopen menselijk bloed met fructose, gefiltreerd runder serum en de virusvoorraad.
Vries 140 microliter bloedmaaltijdmix in voor verdere analyse via TCID50. Plaats vervolgens twee druppels van 50 microliter van de bloedmaaltijdmix in een plastic buisje en laat de muggen gedurende twee uur voeden. Na het verdoven van de muggen, telt u de volledig gevulde individuen en brengt u ze over naar een nieuw buisje met een katoenen kussen gedrenkt in fructose.
Bewaar vervolgens de muggen gedurende 14 of 21 dagen bij 27 graden Celsius en 80% vochtigheid. Vul de met fructose verzadigde katoenen kussens om de 72 uur aan met 1,5 milliliter fructose. Zaai eerst 20.000 Vero-cellen per putje in een 96-wellplaat met aangevuld groeimedium.
Plaats om het speekselapparaat voor te bereiden een vierkante glazen plaat in een hoek van 30 graden op de werkbank. Plak vervolgens dubbelzijdig plakband op de bovenkant van de glazen plaat. Rol vervolgens modelklei tot het een diameter van 0,5 centimeter heeft en bevestig het horizontaal op één centimeter afstand van het dubbelzijdige plakband aan de plaat.
Snij de uiteinden van het vereiste aantal 10-microliter filtertips af en vul elke tip met 10 microliter PBS. Plaats vervolgens de tips op de modelklei en zet ze vast met zachte druk. Immobiliseer vervolgens de muggen door hun poten en vleugels te verwijderen.
Bevestig de muggen aan het plakband boven de filtertips. Plaats voorzichtig de proboscis van elke mug in een filtertip. Verwijder na 30 minuten de filtertips en gooi de klei en het plakband weg.
Breng het verzamelde speeksel over in reactiebuisjes die 10 microliter PBS bevatten. Meng het speeksel en PBS voorzichtig en breng het mengsel over in de putjes van een 96-wellplaat. Incubeer de plaat gedurende zeven dagen bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.
Controleer de cellen met behulp van een lichtmicroscoop op het voorkomen van cytopathische effecten. Zodra een putje positief is voor cytopathische effecten, gebruikt u een pipet om 140 microliter supernatant te oogsten. Breng vervolgens het supernatant over in een reactiebuisje.
Meng vervolgens 140 microliter van het supernatant met 560 microliter AVL-buffer en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Voeg tenslotte 560 microliter ethanol toe en draai het monster om om te mengen. Met dit protocol werden verschillende soorten muggen getest op Zika-virusinfectie en -overdracht onder verschillende klimatologische omstandigheden.
Onder incubatiecondities van 27 graden Celsius vertoonden alle Aedes-soorten Zika-virus-positieve speeksel. Omgekeerd bevatten geen van de speekselmonsters van de Culex-taxa bewijs van het virus. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek worden uitgevoerd voor 50 muggen in één uur als deze goed wordt uitgevoerd.
Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u experimenten met gedwongen speekselafscheiding uitvoert. Vergeet niet dat werken met geïnfecteerde muggen erg gevaarlijk kan zijn, dus speciale veiligheidsmaatregelen voor de omgang met muggen onder BSA-3-omstandigheden moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van elk experiment.
Overzicht
Dit artikel bespreekt een methode voor het analyseren van de vectorcompetentie van muggen, specifiek Aedes albopictus en diverse Culex-taxa, voor de transmissie van het zikavirus. De techniek voor geforceerde salivatie maakt de gelijktijdige analyse van meerdere muggen mogelijk zonder het gebruik van laboratoriumdieren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Vectorbiologie
- Virologie
- Door muggen overgedragen ziekten
Achtergrond
- Het begrijpen van de vectorcompetentie is cruciaal voor de bestrijding van door muggen overgedragen virussen.
- Geforceerde salivatie is een nieuwe methode om het transmissiepotentieel van muggen te beoordelen.
- Eerdere methoden vereisten vaak laboratoriumdieren; deze techniek is erop gericht dit te elimineren.
- Een fijne motoriek is essentieel voor deze methode, waardoor oefening en ervaring noodzakelijk zijn.
Doel van de studie
- Om de vectorcompetentie van verschillende muggensoorten voor het Zika-virus te evalueren.
- Om een methode te demonstreren die high-throughput analyse van muggenspeeksel mogelijk maakt.
- Om een visuele gids te bieden voor onderzoekers die nieuw zijn met deze techniek.
Gebruikte methoden
- Bereiding van een bloedmaaltjesmengsel voor het voeden van muggen.
- Geforceerde salivatie-techniek om speeksel van muggen te verzamelen.
- Celkweekmethoden om de aanwezigheid van het Zika-virus vast te stellen.
- Incubatie en analyse van monsters op cytopathische effecten.
Belangrijkste resultaten
- Aedes-soorten vertoonden positieve speekselmonsters voor het Zika-virus onder gecontroleerde omstandigheden.
- Culex-taxa vertoonden geen bewijs van het Zika-virus in hun speeksel.
- De methode maakt het mogelijk om tot 50 muggen per uur te testen zodra de techniek beheerst is.
- Visuele demonstraties helpen aanzienlijk bij het aanleren van de techniek.
Conclusies
- Geforceerde speekselafscheiding is een effectieve methode voor het bestuderen van de transmissie van door muggen overgedragen virussen.
- Training en oefening zijn essentieel voor een succesvolle implementatie van de techniek.
- Veiligheidsmaatregelen moeten strikt worden nageleefd bij het hanteren van geïnfecteerde muggen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Assays voor geforceerde speekselvloei maken high-throughput evaluatie van de vectorcompetentie van muggen mogelijk zonder gebruik van diermodellen, wat vroege validatie van targets bij de ontdekking van antivirale middelen ondersteunt. De methode maakt kwantitatieve detectie van replicatiecompetente virussen uit individuele insecten mogelijk, wat bijdraagt aan go/no-go beslissingen voor profylactische of therapeutische kandidaten tegen arbovirussen. De schaalbaarheid en reproduceerbaarheid verhogen het voorspellende vertrouwen bij de preklinische risicoreductie van transmissie-blokkerende interventies.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door het transmissiepotentieel van virussen in individuele ziektevectoren te meten.
- Operationele waarde: Maakt biologische risicoreductie van targets mogelijk via directe beoordeling van de vectorcompetentie onder gecontroleerde omstandigheden.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door het identificeren van niet-competente vectorsoorten, waardoor het aantal fout-positieve leads in arbovirusprogramma's wordt verminderd.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream antivirale screening door de virusgevoeligheid in vectormodellen te bevestigen.
- Operationele waarde: Standaardiseert de verzameling van speeksel en virusdetectie, waardoor reproduceerbare kwantitatieve resultaten over grote cohorten muggen worden gewaarborgd.
- Schaalbaarheid: Faciliteert het hergebruik van het platform voor high-throughput evaluatie van transmissie-blokkerende verbindingen of vaccins.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Sluit aan bij ziekte-relevante systemen door vectorcompetentie te testen onder epidemiologisch relevante temperaturen (18–27°C).
- Operationele waarde: Garandeert continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie via consistente virusmetingen op basis van speeksel.
- Risicobeperking: Ondersteunt beslissingen over verdere ontwikkeling door temperatuurafhankelijke transmissiedrempels vast te stellen voor leidende kandidaten.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode voor geforceerde speekselafscheiding past binnen het continuüm van ontdekking, van targetvalidatie via leadidentificatie tot preklinische evaluatie, in het bijzonder voor interventies gericht op arbovirussen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door de aanwezigheid van het virus in muggenspeeksel te kwantificeren als een functionele readout van het transmissiepotentieel.
- Screening: Biedt assay-gereedheid en reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde speekselverzameling en TCID50-equivalente virusdetectie in Vero-cellen.
- Analytica: Genereert kwantitatieve metingen van de afhankelijke variabele (virale titer in speeksel), waardoor vergelijking tussen soorten, stammen en omgevingscondities mogelijk is.
- Translationeel onderzoek: Legt een verbinding met preklinische continuïteit via temperatuurgestratificeerde transmissiegegevens die representatief zijn voor veldrelevante transmissievensters.
- Bedrijfsvoering en hergebruik: Fungeert als een herbruikbare capaciteit voor het screenen van meerdere arbovirussen (bijv. ZIKV, DENV, CHIKV) over verschillende vectorsoorten heen zonder dat heroptimalisatie nodig is.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid bij doelwitvalidatie, vermindering van mechanistische ambiguïteit in de transmissiebiologie.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid over entomologie- en virologieteams heen.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium binnen antivirale programma's.
- Impact op de portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van empirische gegevens over vectorcompetentie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van muggen, virologie en microchirurgische technieken onder BSL-3-containment.
- Afhankelijk van gespecialiseerde instrumentatie, waaronder salivatieapparaten, incubatoren met nauwkeurige vochtigheidsregeling en microscopie voor het scoren van het cytopathisch effect.
- Noodzaak tot standaardisatie tussen teams voor de bereiding van bloedmaaltijden, incubatietijden en intervallen voor speekselverzameling.
- Overwegingen voor adaptatie omvatten soortspecifieke proboscisgrootte, voedingsgedrag en de morfologie van de speekselklieren bij verschillende vectormodellen.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak van uitgebreide training om bekwaamheid te bereiken en de afhankelijkheid van de methode van het terugwinnen van levensvatbaar virus uit het speeksel.
