Een Micro-CT-gebaseerde methode voor het karakteriseren van laesies en vinden van elektroden in kleine dierlijke hersenen

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neurowetenschappen door het verstrekken van een eenvoudiger, minder foutgevoelig, en meer kwantitatieve methode voor het verifiëren van laesies en het lokaliseren van elektrode locaties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt voor de verificatie van laesies en elektrode sites in de hele hersenen zonder de noodzaak voor sectioning. Het eindproduct is een digitaal 3D-volume van de hersenen en meerdere hersenen kunnen parallel worden verwerkt.

Hoewel deze methode zal worden aangetoond in de rat, kan het ook worden toegepast op andere organismen, zoals muizen en zebravinken. Over het algemeen, individuen nieuw op deze methode zal worstelen, omdat sommige stappen vereisen bijzondere zorg om de beste resultaten te garanderen. Om te beginnen, plaats een geëxtraheerd brein in overfusie oplossing in een 50 milliliter conische buis.

Bewaar het monster twee tot drie dagen met zacht schudden op vier graden Celsius. Zorg ervoor dat het osmium wordt verdund in water en niet in een buffer. Dit komt omdat het water zal fungeren als een mild wasmiddel, waardoor het osmium diep in het weefsel kan doordringen.

Bereid 50 milliliter van 2% osmiumtetroxide in dubbel gedestilleerd water. Plaats vervolgens de hersenen in een nieuwe 50 milliliter conische buis en voeg de osmium tetroxide oplossing. Sluit de buis en sluit deze af met paraffinefolie om lekken te voorkomen.

Bewaar de verzegelde buis op vier graden Celsius met zachte schudden voor twee weken. Zorg ervoor dat de buis horizontaal wordt geplaatst. De hersenen is erg dik en een lange manieren om te reizen door diffusie.

Door de buis horizontaal te plaatsen, kan het osmium dieper in het weefsel komen. Nadat het monster twee weken lang is ingebroed, was het vijf keer met dubbelgedestilleerd water om alle niet-gebonden osmiumtetroxide uit het monster te verwijderen. Was vervolgens het monster met dubbel gedestilleerd water gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius.

Vervang het dubbelgedistilleerde water door vier verdunningen ethanol om het monster te dehydrateren. Om te beginnen met de hars infiltratie proces, verplaats het monster door drie aceton en drie aceton hars verdunningen, dan dompel het monster in 100% hars bij kamertemperatuur om het infiltratieproces voort te zetten. Breng hierna het monster over naar een wegwerpmal.

Bezielt het monster met verse 100% hars gedurende vier uur bij kamertemperatuur. Ontgassen het monster in een vacuümoven gedurende 15 minuten bij 45 graden Celsius. Dan genezen van het monster in een oven voor 48 uur op 60 graden Celsius.

Ten slotte, wanneer het monster klaar is met genezen, schil de wegwerpvorm af en scan het met de Micro-CT-machine. In traditionele secties moet de oriëntatie van de hersenen vooraf worden bepaald. Met behulp van deze Micro-CT-methode kan het digitale volume van de monsterhersenen in drie dimensies worden gemanipuleerd en vrijwel in elke richting worden gesneden.

Scanning elektronenmicroscopie van de voorbereide rattenhersenen bevestigen dat het weefsel niet significant beschadigd was ten behoeve van Micro-CT beeldvorming. Een zebra vink hersenen werd ook voorbereid en gescand volgens dit protocol om het nut van deze methode te testen op andere kleine dierlijke hersenen. Deze techniek kan worden gebruikt om oppervlaktelaesies in de hersenen te vinden, evenals laesies diep in de hersenen.

Deze techniek kan ook worden toegepast op de locatie van enkele tetrodes in situ, elektrolytische laesies, elektrodesporen, tetrode arrays in situ, en silicium sondes in situ. Tijdens een poging deze procedure, het is belangrijk om te onthouden om de hersenen te broeden lang genoeg en met voldoende agitatie. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals optogenetica en twee-fotonbeeldvorming worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de rol die verschillende hersengebieden spelen in verschillende gedragingen.

Deze techniek zou onderzoekers op het gebied van neurowetenschappen in staat kunnen stellen om structuur-functierelaties tussen de hersenen en het gedrag bij ratten, muizen, zangvogels en andere kleine dieren beter te verkennen. Vergeet niet dat het werken met osmium zeer gevaarlijk kan zijn en voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van handschoenen en het werken in een vacuümkap moet altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.