Confocale beeldvorming van Double-Stranded RNA en patroon erkenning receptoren in negatief-Sense RNA-virusinfectie
26 januari 2019
Double-stranded RNA geproduceerd tijdens de replicatie van RNA-virus kan worden herkend door patroon erkenning receptoren voor het opwekken van een aangeboren immuunrespons. Voor negatieve-gevoel van RNA-virussen blijft de interactie tussen de low-level dsRNA en PRRs onduidelijk. We hebben een confocale microscopie methode ontwikkeld om visualiseren Arenavirussen dsRNA en PRR in afzonderlijke cellen.
Traditionele double-strand RNA detectie test is meestal niet gevoelig genoeg om dubbelstreng RNA gevormd in negatieve zin RNA virus infectie op te sporen. Daarom is de interactie tussen dubbelstrengs RNA en host patroon herkenning receptoren grotendeels ongrijpbaar gebleven voor deze virussen. Met behulp van dit protocol zijn we in staat om de interactie tussen virale nucleaire eiwitten, dubbelstreng RNA te visualiseren en te karakteriseren en een PRRs op een eencellig niveau te hosten voor het RNA-virus met een negatief gevoel. Dit is een multiplex test die het mogelijk maakt voor gelijktijdige kleuring van dubbelstrengs RNA en twee virale of gastheer eiwit doelen in individuele cellen. In tegenstelling tot de RNA-FISH test is deze techniek RNA sequentie onafhankelijk en meestal compatibel met antilichaamdetectie van eiwitdoelen. Begin 24 uur voor infectie door zaaien 200.000 menselijke long epitheel A549 cellen op Poly-D-Lysine gecoate glazen deksel slips in 12-well platen en groeien ze op 37
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de herkenning van dubbelstrengs RNA (dsRNA), geproduceerd tijdens de replicatie van RNA-virussen, door patroonherkenningsreceptoren (PRR's) om een aangeboren immuunrespons op te wekken. De focus ligt op RNA-virussen met een negatieve polariteit, waarbij de interactie tussen lage concentraties dsRNA en PRR's nog onvoldoende bekend is. Er is een confocale microscopiemethode ontwikkeld om arenavirus dsRNA en PRR's in individuele cellen te visualiseren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Immunologie
- Virologie
Achtergrond
- Dubbelstrengs RNA is een bijproduct van de replicatie van RNA-virussen.
- Patroonherkenningsreceptoren spelen een cruciale rol in de aangeboren immuunrespons.
- De interactie tussen dsRNA en PRR's bij RNA-virussen met een negatieve polariteit is nog onvoldoende begrepen.
- Het visualiseren van dsRNA en PRR's kan het inzicht in de virale immuunontwijking verbeteren.
Doel van de studie
- Om de interactie tussen dsRNA en PRR's bij RNA-virussen met een negatieve polariteit te verduidelijken.
- Om een methode te ontwikkelen voor het visualiseren van deze interacties in individuele cellen.
- Om bij te dragen aan het begrip van de aangeboren immuunrespons op RNA-virussen.
Gebruikte methoden
- Confocale microscopie voor visualisatie van dsRNA en PRR's.
- Cellulaire assays om de immuunrespons te beoordelen.
- Analyse van dsRNA-niveaus tijdens virale replicatie.
- Vergelijkende studies met verschillende RNA-virussen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van arenavirus dsRNA en PRR's in individuele cellen.
- Identificatie van specifieke interacties tussen dsRNA en PRR's.
- Inzichten in de immuunresponsmechanismen die door dsRNA worden getriggerd.
- Verduidelijking van de rol van dsRNA in de virale pathogenese.
Conclusies
- De ontwikkelde confocale microscopie-methode is effectief voor het bestuderen van interacties tussen dsRNA en PRR.
- Inzicht in deze interacties kan leiden tot nieuwe therapeutische strategieën tegen RNA-virussen.
- Dit onderzoek draagt bij aan het bredere veld van de virale immunologie.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Het visualiseren van dubbelstrengs RNA (dsRNA) met een lage abundantie bij infecties met RNA-virussen met een negatieve polariteit vult een kritisch gat in het begrip van de activering van de aangeboren immuniteit en de immuunevacuatie van virussen. Deze mogelijkheid ondersteunt de validatie van targets en het mechanistische risicobeheer bij de ontdekking van antivirale middelen door directe observatie mogelijk te maken van de interactie tussen patroonherkenningsreceptoren (PRR) en virale replicatieve intermediairen. De methode vergroot het voorspellende vertrouwen bij de selectie van targets in een vroeg stadium voor arenavirussen en aanverwante pathogenen, wat bijdraagt aan de prioritering van portfolio's in programma's voor pathogenen met een hoog inperkingsniveau.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door dsRNA-PRR-interacties te visualiseren met een resolutie op single-cell niveau in pathogene virusmodellen.
- Operationele waarde: Biedt een gevoelige, sequentie-onafhankelijke detectiemethode die compatibel is met gemultiplexte eiwitkleuringen voor de verduidelijking van signaalpaden.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt het biologisch minimaliseren van risico's voor PRR-targets door ligandbinding te bevestigen in relevante infectiecontexten.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert kwantitatieve, ruimtelijk opgeloste read-outs van de colokalisatie van dsRNA en PRR voor de standaardisatie van de assay.
- Relevantie voor screening: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream compound-screening door baseline-metrieken voor immuunactivatie vast te stellen.
- Platformnut: Compatibel met antilichaamgebaseerde detectie, waardoor hergebruik mogelijk is voor verschillende virale targets en gastheerproteïnen in imaging-workflows.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen observaties uit fundamenteel onderzoek en preklinische validatie door de distributie van dsRNA en de rekrutering van PRR in ziekterelevante systemen in kaart te brengen.
- Mechanistisch inzicht: Verheldert de ruimtelijke en temporele dynamiek van innate immuunsignalering, wat bijdraagt aan de selectie van biomarkers voor pathway-modulatie.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Maakt datagedreven go/no-go-beslissingen mogelijk op basis van visuele bevestiging van target-engagement in modellen met een hoge pathogeniteit.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van hypothesetoetsing van targets via lead-identificatie tot preklinische validatie, in het bijzonder voor immunomodulerende antivirale middelen die zich richten op PRR-paden.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van PRR-agonist/antagonist-mechanismen door dsRNA te visualiseren als de endogene ligand in geïnfecteerde cellen.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve imaging-outputs die vergelijking mogelijk maken van de effecten van verbindingen op dsRNA-PRR-interacties.
- Analytics: Biedt gemultiplexte fluorescentie-readouts (dsRNA, viraal eiwit, PRR) voor high-content analyse van immuunactivatietoestanden.
- Translationeel onderzoek: Verbindt in vitro observaties met preklinische continuïteit door PRR-activatie te bevestigen in primaire of uit stamcellen afgeleide longepitheelmodellen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een gestandaardiseerd imaging-platform dat toepasbaar is op meerdere RNA-virussen met negatieve polariteit en gastheerdoelen buiten arenavirussen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in PRR-ligandinteracties te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van assays via gestandaardiseerde confocale protocollen en gevoelige dsRNA-detectie.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen door direct visueel bewijs van pathway-modulatie te leveren, waardoor uitval in een laat stadium wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van immunomodulerende kandidaten mogelijk op basis van bevestigde target-engagement in pathogenen-viruscontexten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in confocale microscopie, immunofluorescentiekleuring en virologische technieken die passen bij het betreffende biosafety-niveau.
- Afhankelijk van toegang tot hooggevoelige dsRNA-antilichamen (bijv. kloon 9D5) en een compatibele fluorescentie-beeldvormingsinfrastructuur.
- Nektiseert standaardisatie tussen laboratoria voor een consistente kwantificering van het dsRNA-signaal en colocalisatie-analyse.
- Er moet rekening worden gehouden met variabiliteit in celmodellen (bijv. A549 versus primair luchtwagepitheel) wat betreft dsRNA-productie en PRR-expressieniveaus.
- Praktische beperkingen omvatten potentiële kruisreactiviteit van antilichamen en de noodzaak van optimalisatie in omgevingen met een hoge inperkingsgraad (BSL-3/BSL-4).
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
Title
1:05
Preparation of A549 Cells and JUNV (Junn virus) Infection
2:09
Fixation and Immunostaining
5:10
Results: Distribution and Colocalization Between the Retinoic Acid Like Receptors RLRs (RIG-I and MDA-5) and dsRNA in JUNV-infected Cells
5:52
Conclusion
