Beoordeling van de beschikbaarheid van mineralen in visvoeders met behulp van aanvullende methoden die zijn aangetoond met het voorbeeld van zink in Atlantische zalm
29 oktober 2021
In dit artikel wordt in detail een systematische aanpak uitgelegd om de beschikbaarheid van micromineralen in Atlantische zalm te beoordelen. De methodologie omvat instrumenten en modellen met toenemende biologische complexiteit: (1) chemische soortanalyse, (2) in vitro oplosbaarheid, (3) opnamestudies in cellijnen en (4) in vivo visstudies.
We bestudeerden de beschikbaarheid van oplosbaarheid van micrometalen zoals zinkseleen met verschillende chemische vormen of bronnen, zoals we het noemen, in de context van veranderende voersamenstelling. Weeg in een radionuclidesuite ongeveer 0,2 gram gemalen Atlantische zalmvoermonsters af en meng deze met een zinkradiotracer met bekende specifieke activiteit in een monsterbuis van vijf milliliter volume. Bereid zes andere aliquots van de buffer en voeg een van de hier afgebeelde aminozuren toe aan elk om een uiteindelijke molaire concentratie van vijf millimolar te bereiken.
Voeg zoetwater intestinale luminale buffer toe om het monster te voeden. Voeg vervolgens de zoetwater intestinale luminale buffer toe aan de buffer aliquots die de aminozuren bevatten. Sluit de buizen en draai ze op een roterende spinner met 25 RPM gedurende 30 minuten.
Centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 1. 157 x g om de oplosbare en niet-oplosbare fracties te scheiden. Gebruik een gammateller om het aantal per minuut van de zinkradiotracer in de oplosbare en niet-oplosbare fracties te meten. Was de van regenboogforel afgeleide darmcellijn tweemaal met één milliliter EDTA-oplossing en hevel de oplossing na elke wasbeurt uit met een pipet.
Behandel de gewassen cellen met 0,25% trypsine-oplossing. Draai de kolf voorzichtig twee minuten onder scherpe hoeken. Voeg vervolgens 10 milliliter L-15 medium met 5% FBS toe om het trypsine te neutraliseren.
Decanteer met behulp van een steriele pipet de resulterende celsuspensie in een conische centrifugebuis aan de onderkant. Centrifugeer bij 130 x G gedurende drie minuten. Bepaal vervolgens met behulp van een hemocytometer de dichtheid van de geoogste cellen door handmatig te tellen.
Zaai de cellen op 24 putplaten met een celdichtheid van 50.000 cellen per milliliter, per put, en incubeer de platen bij 19 graden Celsius onder een normale atmosfeer gedurende 48 uur voorafgaand aan de experimenten. Na het voeren van de vis gedurende 11 dagen en het euthanaseren, verzamel je een gepoold monster van de uitwerpselen van de vis door van de ventrale vin naar de anus te strippen en op een bord te leggen. Gebruik een spatel om de uitwerpselen van de plaat over te brengen in een conische buis van 50 milliliter.
Bewaar de monsters onmiddellijk bij 20 graden Celsius. In deze studie wordt de minerale beschikbaarheid van visvoer beoordeeld met behulp van een aantal complementaire methoden. Representatieve analyse van Atlantisch zalmvoer via de grootte-uitsluitingschromatografie inductief gekoppelde plasmamassaspectrometriemethode, levert gegevens op over de zinkchemische soorten die in de oplosbare fractie worden aangetroffen.
In deze fractie zijn vijf zinkhoudende pieken te zien, elk met een ander molecuulgewicht. De zinkchemische soorten die in de oplosbare fractie worden aangetroffen, kunnen verschillende bronnen hebben, omdat het gebruikte voer zowel mariene als plantaardige ingrediënten bevat en wordt aangevuld. Het molecuulgewichtsbereik van deze soorten suggereert dat deze verbindingen metalloproteïnen kunnen zijn.
Terwijl de oplosbaarheid van aangevuld zink 65 de aanwezigheid van alle geteste aminozuren verhoogt, wordt een hogere oplosbaarheid gevonden met histidine en lysine. Apicale zinkopname in Arteca GC-cellen wordt significant beïnvloed door de aanwezigheid van L-Met of DL-Met bij twee millimolarconcentraties. Bovendien wordt de impact van methionine op de zinkopname negatief beïnvloed door de aanwezigheid van BCH.
Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat we hebben geprobeerd om verschillende benaderingen te combineren in visuele, analytische en invivo-studies, om elkaar te vergelijken en aan te vullen als het gaat om het bestuderen van de beschikbaarheid van mineralen.
Overzicht
Dit artikel presenteert een systematische benadering om de beschikbaarheid van zink (Zn) in voeding voor Atlantische zalm (Salmo salar) te beoordelen. Door analytische, in vitro en in vivo methodologieën te integreren, onderzoekt de studie hoe verschillende chemische Zn-soorten in voer de oplosbaarheid en opname van Zn beïnvloeden. De beschreven protocollen bieden een uitgebreid kader voor het evalueren van de biologische beschikbaarheid van dierlijke micro-mineralen in aquacultuure-voedingsonderzoek.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Voeding in de aquacultuur
- Analyse van sporenelementen
- Visfysiologie
Achtergrond
- Het beoordelen van de beschikbaarheid van dierlijke micro-mineralen is een aanzienlijke uitdaging in de visvoeding.
- Voeders bevatten verschillende chemische Zn-soorten, wat mogelijk de Zn-biobeschikbaarheid beïnvloedt.
- Inzicht in de oplosbaarheid van Zn en de opnamemechanismen is cruciaal voor het optimaliseren van de visgezondheid en de voersamenstelling.
- Het combineren van meerdere methodologieën kan een completer beeld geven van de mineraalbeschikbaarheid.
Doel van de studie
- Om de beschikbaarheid van verschillende chemische Zn-soorten in voer voor Atlantische zalm systematisch te evalueren.
- Om in vitro- en in vivo-methoden voor het beoordelen van de Zn-oplosbaarheid en -opname te vergelijken.
- Om de invloed van aminozuurliganden op de Zn-biobeschikbaarheid te bepalen.
Gebruikte methoden
- Extractie en analyse van Zn-soorten uit voer met behulp van grootte-uitsluitingschromatografie-inductief gekoppelde plasma-massaspectrometrie (SEC-ICP-MS).
- In vitro oplosbaarheidsbeoordeling van dieet-Zn met behulp van radiotracertechnieken en aminozuuraanvulling.
- Meting van de Zn-opname in een darmepitheelcellijn van de regenboogforel (RTgutGC).
- In vivo voederproef met Atlantische zalm, gevolgd door fecesverzameling en analyse om de schijnbare Zn-beschikbaarheid te bepalen.
Belangrijkste resultaten
- Meerdere chemische Zn-soorten met variërende molecuulgewichten werden geïdentificeerd in de oplosbare fractie van de voeding.
- De Zn-oplosbaarheid nam toe in de aanwezigheid van alle geteste aminozuren, waarbij histidine en lysine de sterkste effecten vertoonden.
- De Zn-opname in RTgutGC-cellen werd significant beïnvloed door methionine, en dit effect werd gemoduleerd door de aanwezigheid van BCH.
- De in vitro bevindingen correleerden niet volledig met de in vivo resultaten, wat de complexiteit van de beoordeling van de Zn-biobeschikbaarheid benadrukt.
Conclusies
- Voer bevat diverse Zn-soorten, en de efficiëntie van organische Zn-bronnen is afhankelijk van het specifieke aminozuurligand dat voor chelatie wordt gebruikt.
- In vitro-protocollen bieden waardevolle inzichten, maar kunnen niet altijd de in vivo mineralenbeschikbaarheid voorspellen.
- Een gecombineerde methodologische aanpak vergroot het begrip van de Zn-biobeschikbaarheid in visvoer.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Een systematische beoordeling van de biologische beschikbaarheid van mineralen in aquaculturevoeders is essentieel voor een voorspellende betrouwbaarheid bij nutritionele optimalisatie en risicogebaseerde voersamenstelling. Door analytische, in vitro en in vivo methoden te integreren, kan de mechanistische risicoanalyse van de toediening van micronutriënten worden verbeterd, wat de translationele continuïteit ondersteunt van ontdekking tot toegepaste voederontwikkeling. Deze benadering vormt de basis voor portfoliobeslissingen over de selectie van ingrediënten en supplementatiestrategieën voor verbeterde visgezondheid en groeiresultaten.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt het mogelijk om mineralenopname-mechanismen te onderzoeken en de pathways voor micronutriëntenabsorptie te verduidelijken.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door het onderscheid te maken tussen de impact van verschillende zinkchemische species op de biobeschikbaarheid.
- Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij het selecteren van effectieve mineraalbronnen voor voerformuleringen.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde in vitro- en analytische systemen voor voor de kwantitatieve beoordeling van mineralensolubiliteit en -opname.
- Standaardiseert protocollen voor reproduceerbare meting van zinksoorten en hun biobeschikbaarheid.
- Maakt betrouwbare screening van voederingrediënten en chelatiestrategieën voor mineraalsupplementatie mogelijk.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt in vitro- en in vivo-bevindingen aan elkaar om de translationele relevantie van gegevens over de biobeschikbaarheid van mineralen te beoordelen.
- Ondersteunt de continuïteit van mechanistische ontdekking naar preklinische validatie in de aquacultuurvoeding.
- Informeert de risico-gecorrigeerde verdere ontwikkeling van voerformuleringen op basis van vergelijkende resultaten van de biobeschikbaarheid.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze multi-methode aanpak omvat de fasen van vroege ontdekking tot preklinische voederevaluatie en integreert analytische chemie, celgebaseerde assays en in vivo validatie voor een uitgebreide beoordeling van de biologische beschikbaarheid van mineralen.
- Ontdekkingsbiologie: Verduidelijkt de invloed van zinkchemische soorten en aminozuurliganden op opname-mechanismen.
- Screening: Levert kwantitatieve gegevens over oplosbaarheid en opname om de selectie van ingrediënten en de formulering te onderbouwen.
- Analytiek: Biedt zinkspeciatie op basis van molecuulgewicht en opmetingen van de opname via radiotracers.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen in vitro-bevindingen en in vivo-resultaten om beslissingen over voederontwikkeling te sturen.
- Bedrijfsvoering en hergebruik: Vestigt een herbruikbaar kader voor de beoordeling van de biologische beschikbaarheid van mineralen voor verschillende voeder- en diersoorten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in onderzoek naar mineralenvoeding.
- Operationele waarde: Standardiseert en schaalt protocollen voor een reproduceerbare beoordeling van de biobeschikbaarheid van mineralen over verschillende studies heen.
- Strategische waarde: Maakt geïnformeerde go/no-go-beslissingen mogelijk voor de selectie van voederingrediënten en supplementen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van voerformuleringen en supplementatiestrategieën.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in analytische chemie, celkweek en in vivo aquacultuurstudies.
- Toegang tot SEC-ICP-MS instrumentatie en faciliteiten voor het omgaan met radiotracers is noodzakelijk.
- Standaardisatie van protocollen tussen teams is vereist voor vergelijkbaarheid en reproduceerbaarheid.
- Aanpassing kan noodzakelijk zijn voor verschillende vissoorten of voermatrijsen.
- Beperkingen in de in vitro-in vivo correlatie moeten worden meegewogen bij de interpretatie van de resultaten.
Veelgestelde vragen over Biofarma
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:31
In Vitro Solubility of Supplemented Zn in Atlantic Salmon
1:33
Cell Harvest and Preparing for Exposure Experiments
2:49
Apparent Availability of Dietary Zn in Atlantic Salmon (Salmo salar)
3:13
Results: Mineral Availability in Fish Feeds
4:23
Conclusion
