Celtype-specifieke genexpressie profilering in de muis lever
17 september 2019
Vertalen van ribosoom affiniteits zuivering (trap) maakt snelle en efficiënte isolatie van celtypespecifieke vertalen mRNA. Hier demonstreren we een methode die hydrodynamische staart-ader injectie combineert in een muismodel van lever repopulatie en val om het uitdrukkings Profiel van het herbevolkende hepatocyten te onderzoeken.
Met TRAP-seq kunnen we het RNA isoleren van specifieke celtypen, zoals de hepatocyten die opnieuw in gewonde lever komen om de veranderingen in genexpressie in die cellen te analyseren. Het vereist geen stappen om ongewenste cellen uit het weefsel te verwijderen. Het celtype-specifieke RNA wordt geïsoleerd door affiniteitszuivering van hele orgaanlysates.
Deze techniek helpt ons bepalen hoe specifieke cellen reageren op verwondingen, die kunnen helpen bij het identificeren van nieuwe strategieën of geneesmiddelen om leverziekte te bestrijden. Dit kan worden gebruikt om te bepalen hoe levercellen reageren op verschillende soorten leverletsels. Momenteel zijn er weinig opties voor ernstige acute leverletsels en deze methode zal helpen om aanwijzing ons in nieuwe behandelingen.
Deze methode is ontstaan in de hersenen. In de lever, we voor ogen het zou kunnen worden gebruikt om dynamische veranderingen in een verscheidenheid van celtypes te onderzoeken, de hepatocyten, galkanaalcellen, Kupffer cellen, en endotheelcellen om er een paar te noemen. Demonstreren van de procedure zal Amber Wang, een afgestudeerde student en mijn mentee.
Om te beginnen, resuspend magnetische kralen door zachte pipetting. Verzamel de kralen op een magnetische standaard voor meer dan een minuut en verwijder de supernatant. Verwijder vervolgens de microcentrifugebuis van de magnetische standaard en voeg een milliliter PBS toe, gevolgd door pipetten op en neer om de kralen te wassen.
Plaats de buis terug op de magnetische standaard voor meer dan een minuut om de kralen te verzamelen en verwijder de PBS. Om eiwit L-gecoate kralen voor te bereiden, voeg 16 microliter biotinylated eiwit L toe aan de opnieuw opgespente en gewassen magnetische kralen en voeg 1X PBS toe om het uiteindelijke volume een milliliter te maken, bij gebruik van een 1,5-milliliter microcentrifugebuis, of 1,5 milliliter, bij gebruik van een twee-milliliter microcentrifuge buis. Broed de magnetische kralen met biotinylated eiwit L gedurende 35 minuten bij kamertemperatuur op een buis rotator.
Plaats vervolgens de buis meer dan een minuut op de magnetische standaard en verwijder de supernatant om het eiwit L-gecoate kralen te verzamelen. Haal de microcentrifugebuis van de magnetische standaard en voeg een milliliter PBS toe met een BSA-buffer van 3%, gevolgd door minstens vijf keer zachte pipetten om de eiwit L-gecoate kralen te wassen. Nogmaals, plaats de buis op de magnetische standaard voor meer dan een minuut en verwijder de supernatant om de gecoate kralen te verzamelen.
Herhaal de BSA wassen nog eens vier keer. Voeg vervolgens 50 microgram antilichamen voor GFP-antilichaam 19C8 en GFP-antilichaam 19F7 toe aan het eiwit L-gecoate kralen en broed gedurende een uur bij vier graden Celsius op een buisdrammer. Om de affiniteitsmatrix te verzamelen, plaatst u de buis meer dan een minuut op de magnetische standaard en verwijdert u de supernatant.
Haal de buis uit de buurt van de magnetische standaard en voeg een milliliter zoutbuffer toe. Voorzichtig pipet op-en-neer om de affiniteit matrix te wassen en herhaal de zoutarme buffer wassen nog eens twee keer. Resuspend de kralen in 200 microliters van low-salt buffer, om 200 microliters van affiniteit matrix te maken.
Stel eerst de weefselmolen in zodat de PTFE-glasbuizen tijdens de homogenisatie op ijs kunnen worden geplaatst. Vul vier milliliter koude lyse buffer in de PTFE glazen buizen. Leg de lever op een petrischaaltje.
Gebruik een mes om 200 tot 500 milligram leverstukken te isoleren en in de PTFE glazen buizen te gaan. Plaats het resterende leverweefsel in een voorgekoelde microcentrifugebuis en flash freeze in vloeibare stikstof. Homogenize de monsters in een motorisch aangedreven homogenisator, beginnend bij 300 rpm gedurende ten minste vijf slagen om hepatocyten te scheiden van de leverstructuur.
Laat de glazen buis telkens zakken. Voorkom beerting, die eiwitverdenaturatie kan veroorzaken, door de stamper onder de oplossing te houden. Verhoog vervolgens de snelheid naar 900 rpm om de leverweefsels volledig te homogeniseren voor ten minste 12 volledige slagen.
Breng het lysaat in gelabelde en voorgekoelde buizen met niet meer dan een milliliter lysaat elk. Om te beginnen met nucleaire lysis, centrifugeren de lever lysaat op 2,000 keer g op vier graden Celsius gedurende 10 minuten, dan de overdracht van de supernatant naar een nieuwe voorgekoelde microcentrifuge buis op ijs. Voeg 1/9e van het supernatant volume van 10%NP-40 toe aan de microcentrifugebuis op ijs en meng de oplossing door de buis voorzichtig om te keren.
Draai snel de microcentrifugebuizen met een minicentrifuge naar beneden en voeg 1/9e van het monstervolume van 10% DOC. Meng door de microcentrifugebuizen voorzichtig om te keren en draai snel de microcentrifugebuizen naar beneden en broed gedurende vijf minuten op ijs. Centrifugeer het kernlysaat op 20.000 keer g bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten en breng het supernatant over op nieuwe voorgekoelde microcentrifugebuizen op ijs.
Neem voor elke buis 1% van het totale volume van de supernatant eruit als pre-immunoprecipitatiecontrole. Plaats de pre-immunoprecipitatie controles op een buis rotator op vier graden Celsius 's nachts. Wees extra voorzichtig met het voorzichtig opnieuw oplichten van de affiniteitsmatrix door pipetting en voeg vervolgens 200 microliters toe aan elk monster.
Incubeer de lysates op vier graden Celsius 's nachts met zachte mengen op een buis rotator. Om RNA te isoleren, draai je snel de buizen met de lysaten in de minicentrifuge naar beneden en verzamel je de kralen door minstens één minuut op het magnetische rek te plaatsen. Verzamel de supernatant in extra microcentrifugebuizen.
Voeg een milliliter verse zoutbuffer met veel zout toe aan elke buis, gevolgd door minstens vijf keer zachte pipetting zonder bellen te introduceren. Verzamel de kralen op de magnetische standaard op ijs voor meer dan een minuut en verwijder de supernatant. Herhaal de wasstappen nog vier keer.
Verwijder vervolgens de microcentrifugebuizen van de magnetische standaard en plaats vijf minuten op kamertemperatuur om op te warmen. Resuspend de kralen in 100 microliters van lyse buffer met 0,7 microliter bèta-mercaptoethanol om gebonden RNA vrij te geven van de affiniteit matrix. Vortex de buizen voor ten minste vijf seconden op de hoogste snelheid en snel spin naar beneden.
Vervolgens, incubeer de buizen op kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Plaats de buizen minstens één minuut op de magnetische standaard, verzamel vervolgens de supernatant en ga onmiddellijk door naar RNA-opruiming volgens het RNA-zuiveringsprotocol in de kit. Voer alle optionele stappen uit, inclusief DNase-vertering en alle RNA-elutiestappen, inclusief de aanbevolen voorverwarming van de elutiebuffer tot 60 graden Celsius.
In deze studie werden GFP-L10A-fusie en Fah-transgenes mede-geleverd binnen een transposon-bevattende plasmide valvector naar levers door hydrodynamische injectie. Het verwijderen van nitisinone veroorzaakte een toxisch leverletsel. Immunofluorescentie kleuring bevestigde de coexpressie van de FAH en GFP-L10A fusie-eiwit en de herbevolking hepatocyten na twee weken van leverherbevolking.
Het rustige monster produceerde de hoogste opbrengst van fusie-eiwit, omdat alle hepatocyten na AAV8-TBG-Cre injectie GFP-L10A uitdrukken. Omgekeerd was er nauwelijks RNA detecteerbaar in wild-type controles die niet over de GFP-L10A transgene, wat aangeeft dat de TRAP procedure is zeer specifiek en heeft een lage achtergrond. Toen TRAP werd gebruikt op leverweefsel dat herbevolking onderging met GFP-L10A-transduceerde hepatocyten, werd overvloedig RNA van hoge kwaliteit verkregen.
Daarentegen werd geen RNA-spoor gedetecteerd via Bioanalyzer voor het negatieve controlemonster. Gsta1 expressie werd veroorzaakt door meer dan tienvoudige in het herbevolken van hepatocyten in vergelijking met rustige hepatocyten, terwijl er geen drempelcyclus waarden werd gedetecteerd met TRAP-geïsoleerde RNA van het wilde type muis als gevolg van het ontbreken van input RNA. Bij het homogeniseren van het weefsel, zorg ervoor dat de stamper langzaam te verplaatsen om beerting te voorkomen.
Na het isoleren van het RNA kunnen hoge-doorvoer sequencing of qPCR worden uitgevoerd om genexpressie te analyseren. Met TRAP-seq hebben we nu een methode om RNA specifiek te isoleren van het herbevolken van hepatocyten en de verandering in genexpressie tijdens leverherbevolking te analyseren. Dit stelt ons in staat om genen te identificeren die tijdens dit proces worden gewijzigd en potentiële therapeutische doelen voor de behandeling van leverletsel.
Cycloheximide en DTT, die aanwezig zijn in verschillende buffers, zijn beide giftig. Afval moet worden ingezameld en weggegooid volgens institutionele richtlijnen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie demonstreert de toepassing van Translating ribosome affinity purification (TRAP) in combinatie met hydrodynamische staartvene-injectie in een muismodel om translerend mRNA te isoleren uit repopulerende hepatocyten in de lever. De methode toont het potentieel aan om het expressieprofiel van deze specifieke cellen tijdens leverrepopulatie te analyseren.
Belangrijkste componenten van de studie
Onderzoeksgebied
- Celtype-specifieke genexpressie
- Leverrepopulatiestudies
- Schaderespons in levercellen
Achtergrond
- Het begrijpen van de reacties van levercellen op letsel is essentieel voor de ontwikkeling van nieuwe behandelingen.
- Huidige methoden voor het isoleren van specifiek cel-RNA vereisen vaak het verwijderen van ongewenste cellen.
- TRAP maakt een efficiënte isolatie uit lysaten van het gehele orgaan mogelijk.
Gebruikte methoden
- Vertalende ribosoomaffiniteitszuivering (TRAP-seq) voor RNA-isolatie
- Muismodel voor leverrepopulatie
- Hydrodynamische staartvene-injectie
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle isolatie van RNA uit repopulerende hepatocyten.
- Beoordeling van veranderingen in genexpressie tijdens het herstel van leverschade.
- Verschaffing van inzichten in specifieke celresponsen die behulpzaam kunnen zijn bij het bepalen van behandelstrategieën voor leverziekten.
Conclusies
- Deze studie demonstreert het nut van TRAP bij het onderzoeken van dynamische veranderingen in leverceltypen.
- De bevindingen zijn relevant voor het verbeteren van het begrip van de leverbiologie en potentiële therapeutische benaderingen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Celtype-specifieke genexpressieprofilering in de lever van muizen met behulp van TRAP-seq maakt de nauwkeurige isolatie van vertalend mRNA uit repopulerende hepatocyten mogelijk zonder cel sortering, waardoor de oorspronkelijke transcriptionele toestanden behouden blijven. Deze aanpak ondersteunt targetvalidatie door letsel-geïnduceerde transcriptionele veranderingen in een ziekterelevant systeem te onthullen, wat het mechanistische de-risking van therapeutische kandidaten vergemakkelijkt. De methode levert kwantitatieve, reproduceerbare gegevens die kunnen bijdragen aan leadidentificatie en de selectie van preklinische modellen voor behandelingen van leverletsel.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door mRNA uit repopulerende hepatocyten te isoleren om genen te identificeren die reageren op letsel.
- Operationele waarde: Voorkomt artefacten door cel-sortering door gebruik te maken van affiniteitszuivering van translerende ribosomen direct uit weefsellysaten.
- Voorspellende waarde: Levert genexpressiesignaturen die het vertrouwen in targets ondersteunen en helpen bij de prioritering van portfolio's voor leverziekte-indicaties.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert hoogwaardig, celtype-specifiek RNA dat geschikt is voor qPCR of high-throughput sequencing om de effecten van verbindingen te beoordelen.
- Operationele waarde: Standaardiseert het inputmateriaal door translerend mRNA te isoleren uit gedefinieerde hepatocytpopulaties, waardoor de variabiliteit wordt verminderd.
- Schaalbaarheid: Compatibel met downstream profileringsplatforms voor screeningstoepassingen in letselmodellen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Koppelt genexpressieveranderingen in de ontdekkingsfase aan fenotypische resultaten bij leverrepopulatie, wat bijdraagt aan de afstemming van translationele biomarkers.
- Operationele waarde: Maakt consistente vergelijkingen mogelijk tussen verschillende letselmodellen en tijdstippen met behulp van het Fah-/- muissysteem.
- Risicobeheersing: Ondersteunt preklinische validatie door target-engagement in het relevante celtype tijdens de regeneratie te bevestigen.
Integratie van Pipeline & Workflow
TRAP-seq past binnen het ontdekkingscontinuüm van doelwitidentificatie via lead-optimalisatie tot preklinische validatie, in het bijzonder in modellen van leverschade waarbij cellulaire specificiteit cruciaal is.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door te onthullen hoe specifieke hepatocyten-subpopulaties reageren op toxische schade en regeneratieprikkels.
- Screening: Levert RNA-inputs die klaar zijn voor assays om veranderingen in genexpressie door verbindingen te evalueren in ziekterelevalente hepatocyten.
- Analytiek: Levert kwantitatieve transcriptomische readouts die vergelijking van condities en pathway-modulatie mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt moleculaire veranderingen in repopulerende hepatocyten aan functioneel herstel, wat bijdraagt aan preklinische continuïteit.
- Bedrijfbrede hergebruik: Aanpasbaar aan andere celtypen (bijv. Kupffer-cellen, endotheelcellen) via promoter-gestuurde ribosomale tagging, waardoor hergebruik van het platform over verschillende projecten mogelijk is.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid door mechanistische ambiguïteit in hepatocyt-specifieke letselresponsen te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde affiniteitszuivering van translerend mRNA zonder celisolatiestappen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroegtijdige, celtype-specifieke moleculaire gegevens over targetmodulatie te verschaffen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van expressie in pathogene versus rustende hepatocytenstaten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in moleculaire klonering en de generatie van transgene modellen voor celtype-specifieke ribosomale tagging.
- Afhankelijk van toegang tot apparatuur voor hydrodynamische injectie en infrastructuur voor magnetische scheiding voor zuivering op basis van beads.
- Noodzaakt gestandaardiseerde protocollen voor weefselhomogenisatie, lysis en RNase-vrije hantering om de RNA-integriteit te behouden.
- Aanpassing aan alternatieve modellen of celtypen kan validatie van de promoter-specificiteit en transgene expressieniveaus vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten de afhankelijkheid van transgene expressie en potentiële toxiciteit van cycloheximide-bevattende buffers gebruikt bij lysis.
