Karakterisering van Amyloïde Structuren in Aging C. Elegans met behulp van Fluorescentie Lifetime Imaging

De methode stelt ons in staat om geïntegreerde amyloïde eiwitstructuren duidelijk te onderscheiden van de oplosbare en zelfs geaccumuleerde tegenhangers. De techniek wordt in vivo uitgevoerd op een niet-invasieve manier met weinig of geen toxische bijwerkingen. Omdat het afhangt van de fluorescerende eigenschappen van de fluorofofof zelf, is het zeer robuust en reproduceerbaar na verloop van tijd.

FLIM is gebruikt op het gebied van kankerdiagnose. We gebruiken het echter om de basismechanismen van eiwitaggregatie te bestuderen die inderdaad relevant zijn voor neurodegeneratieve ziekten. De methodologie kan worden gebruikt op het gebied van eiwitaggregatie.

Zolang de ziekte geassocieerde eiwit is gelabeld met een fluorescerende sonde, het kan worden gevolgd en gecontroleerd na verloop van tijd. Verbindingen en strategieën die aggregatie bevorderen of voorkomen, kunnen met succes worden bestudeerd. Elk biologisch systeem dat het mogelijk maakt om te worden gevisualiseerd door lichtmicroscopie is geschikt voor FLIM, hetzij in vivo of ex vivo, bijvoorbeeld in celkweek, in gefixeerde of door middelgrote monsters en in alle benodigde middelen.

Zorg ervoor dat u de eigenschappen van uw geselecteerde fluorofolaat in de aaltjes test voordat u experimentele gegevens verkrijgt en test of de installatie volledig functioneel is voordat u metingen verwerft. Om te beginnen, groeien en onderhouden van aaltjes op 20 graden Celsius op NGM platen. Leeftijd de aaltjes tot dag vier van het leven als de jonge volwassenen en dag acht van het leven als de oude volwassenen.

Op de dag van de beeldvorming, beginnen met het voorbereiden van de beeldvorming dia's. Plaats agarose en dubbel gedestilleerd water bij een volumeconcentratie van 3%. Breng het in een magnetron te smelten en laat het dan iets afkoelen.

Snijd de punt van een een milliliter pipet tip en neem ongeveer 200 microliter van de gesmolten agarose. Pipette de agarose op een schone glazen glijbaan en onmiddellijk plaats een tweede op de top het vermijden van de vorming van eventuele bubbels. Laat de glijbanen drogen en verwijder voorzichtig de bovenste glazen schuif.

Het resultaat is een glazen schuif met een gelijkmatig egaal oppervlak waar de aaltjes worden geplaatst. Zodra de imaging setup is klaar voor gebruik, werken onder een stereo microscoop, plaats een 10 microliter druppel van verdovingsstof op een agarose pad en voorzichtig overdracht vijf tot 10 aaltjes in. Gebruik een wimperpunt om de aaltjes te scheiden.

Houd ze dicht bij elkaar, maar niet aanraken om gemakkelijker lokalisatie van de aaltjes tijdens het verwerven van afbeeldingen mogelijk te maken. Leg de aaltjes voorzichtig over met een coverslip. Neem binnen een uur na montage metingen.

Zorg ervoor dat de aaltjes volledig onbeweeglijk zijn. Open de FLIM acquisitie software. Zoek de tabknop en druk op uitvoer.

Plaats de dia met de gemonteerde C.elegans op het podium en gebruik een 10X vergrotingslens in transmissiemodus, lokaliseer de positie van de aaltjes op de dia. Verwijder de dia, schakel de doelstelling om naar een 63X vergrotingslens en breng het vereiste onderdompelingsmedium aan. Plaats de dia op het podium en lokaliseer de aaltjes.

Begin met het scannen van het monster. Selecteer een interessegebied en focus op het maximale projectievlak. Bekijk op de interface van de FLIM-software het aantal gedetecteerde fotonen.

De ADC-waarde moet tussen één keer 10 tot de vierde en één keer 10 tot de vijfde liggen. Verleg indien nodig de focus op een ander vlak of verhoog de laserkracht om meer fotonen te verzamelen. Zorg ervoor dat u foton stapelen te voorkomen, maar het verzamelen van een voldoende hoeveelheid fotonen om een goede levensduur fit en meting te creëren.

Selecteer op de menubalk het tabblad om de acquisitieparameters in te stellen. Selecteer scansynchronisatie om detectie van één foton mogelijk te maken. Stel de overname in op een vaste tijd of een vast aantal fotonen.

Druk beginnen met acquisitie. Open de software en importeer FLIM-gegevensbestanden via bestand, laad FLIM-gegevens. Laad alle monsters van één voorwaarde, zelfs als het in verschillende sessies en uit verschillende biologische herhalingen wordt verkregen.

Indien nodig, segmenteren om nematode signaal voor veel FLIM beeld via segmentatie, segmentatie manager. Sleep het bijsnijdgereedschap rond het interessegebied totdat het is gemarkeerd. Druk op OK, druk op OK. Selecteer een klein gebied waar de op intensiteit gebaseerde afbeelding van een C.elegans wordt weergegeven.

De vervalcurve van dat gebied verschijnt in het grote vervalvenster aan de rechterkant van de interface. Om de levensduur te extrapoleren, stelt u op het tabblad gegevens een willekeurige geïntegreerde minimumwaarde in tussen 40 tot 300 om pixels uit te sluiten die te zwak zijn om een goede pasvorm te produceren. Selecteer een tijdsminimum en een maximum aantal tijd om het FLIM-signaal tot deze waarden te beperken.

Wijzig het vooraf ingestelde aantal foton van één niet. Voer de herhalingssnelheid in megahertz van de laser gebruikt tijdens de overname. Voer een maximale poortwaarde in om alle verzadigde pixels uit te sluiten.

Selecteer op het tabblad Levensduur een globale fitting die moet worden gebruikt. Wijzig geen andere parameter, behalve het aantal exponentiële selectie als bekend is dat het gekozen fluorescentieverval multi-exponentieel is en meer dan één levensduur vertoont. Upload de IRF via het IRF-menu.

Als u de IRF-shift wilt schatten, selecteert u IRF, schat u de IRF-verschuiving. Er wordt automatisch een set waarden weergegeven op het tabblad IRF. Zodra dit is vastgesteld, mag u geen andere parameters van dit tabblad wijzigen.

Zodra alle parameters zijn ingesteld, drukt u op fit dataset. De resulterende pasvorm die in een blauwe lijn wordt gemarkeerd, moet overlappen met alle gebeurtenissen. Een goede pasvorm wordt verkregen wanneer alle gebeurtenissen langs de pasvorm worden uitgelijnd.

Klik op het tabblad parameters in de rechterbovenhoek van de interface van de software en selecteer statistiek, gewogen gemiddelde en controleer of de vierkante waarde van de chi zo dicht mogelijk bij een waarde is. De levensduurwaarde van de geselecteerde afbeelding wordt dus onthuld als tau one. Exporteer alle informatie van belang via bestand, export intensiteit beelden, fit resultaat tabel, afbeeldingen, histogrammen.

Representatieve kaarten van C.elegans die gespierde Q40 RFP uitdrukken op dag vier of dag acht van het leven worden hier getoond. De langere Q-rek van de IQ85 was meer vatbaar voor aggregatie en vertoonde een fluorescentie levenslange verschuiving in het histogram al op dag vier van het leven. In feite, op dag vier, foci vorming werd waargenomen voor IQ85, terwijl nog steeds afwezig in IQ44.

Bij veroudering vertoonde IQ44 echter ook focivorming en dus een verminderde fluorescentieleven. Ten slotte werd focivorming niet gedetecteerd, noch was een verminderde fluorescentieleven in de NQ40CFP-stam. Voor deze stam, waren er slechts subtiele niet-significante veranderingen in de gemiddelde fluorescentie leven bij veroudering.

Zodra het nematodemodel is vastgesteld, is de hoeveelheid ingezameld foton van het grootste belang om een goede levenslange pasvorm te verkrijgen. De methode kan verder worden samengevoegd met verschillende technieken, zoals Forster resonantie energieoverdracht, FRET, fluorescentieherstel na fotobleaching, FRAP of meting. Al deze aanpassingen geven extra informatie over de eigenschappen van de eiwitstudies en de geaggregeerde vorm.

Op het gebied van eiwitaggregatie en eiwithomeostase, de techniek toegestaan om elke verstoring opgelegd aan het systeem, de distributie van verschillende eiwitsoorten, en de handel en in het algemeen het verschil en de betekenis van oplosbare en onoplosbare eiwitfracties binnen het levende organisme te onderzoeken. De verdovings natrium azide is giftig en moet worden behandeld met handschoenen en bril en verdund onder een rookkap. Omdat de techniek op microscopie is gebaseerd, is het belangrijk om alle waarschuwingen met betrekking tot het werken met lasers te volgen.