Evaluatie van oxidatieve stress in biologische monsters met behulp van de thiobarbiturinezuur reactieve stoffen test

Het TBARS-assay wordt het beste gebruikt voor een algemene intra-laboratorium beoordeling van oxidatieve stress in biologische monsters, waarbij relatieve TBARS-niveaus direct worden vergeleken tussen monsters die samen zijn opgeslagen en verwerkt. Deze assay heeft een extreem lage kostprijs van ongeveer 3 voor het testen van 96 monsters in vergelijking met commercieel verkrijgbare kits, die ongeveer 400 kosten, en slechts één batch monsters toestaan om te worden geanalyseerd. De hier beschreven methode kan verder worden aangepast voor specifieke toepassingen, inclusief stabiliteitsstudies van biospecimens, en voor die waarbij de toevoeging van antioxidanten of andere soorten monsterconserveerders vóór analyse geschikt of vereist is.

Om zeer variabele resultaten te vermijden, bereidt u verse reagentia voor, zorg ervoor dat de pH niet hoger is dan vier voor de kleurreagentia en verwijder eventuele luchtbellen in de nidese-zwelplaat voordat u de absorptie meet. Begin met het bereiden van een 0,8% waterige oplossing van thiobarbituurzuur. Bereid een vijf molaire natriumhydroxide-oplossing door vier gram natriumhydroxidekorrels op te lossen in 20 milliliter water.

Bewaar de oplossing in een plastic container. Deze moet voor elke batch vers worden bereid. Voeg vier gram thiobarbituurzuur toe aan 450 milliliter gedeïoniseerd water en gebruik een magnetische roerstaaf om het voorzichtig op te lossen.

Voeg langzaam ongeveer vier milliliter van de natriumhydroxide-oplossing toe in stappen van 100 microliter, terwijl u de pH controleert terwijl de thiobarbituurzuurdeeltjes oplossen. Blijf natriumhydroxide toevoegen totdat alle deeltjes zijn opgelost. Controleer of de pH van de oplossing niet hoger is dan vier met een pH-strip, breng vervolgens het eindvolume tot 500 milliliter met gedeïoniseerd water en bewaar de waterige thiobarbituurzuur-barbaarse zuuroplossing op kamertemperatuur.

Bereid MDA bis dimethyl acetal standaardcurve-oplossingen in twee milliliter snap cap polypropyleenbuisjes. Door de 200 micromolaire stamoplossing in water te verdunnen zoals beschreven in het tekstdocument. Vortex de monsters.

Label de glazen buisjes voor de te analyseren monsters, voeg vervolgens 100 microliter van de bereide monster toe aan elke buis. Voeg 200 microliter 8,1% SDS toe aan elk monster en schuif de glazen buis in een cirkelvormige beweging om te mengen. Voeg 1,5 milliliter 3,5 molare natriumacetaatbuffer toe aan elk monster, voeg vervolgens 1,5 milliliter van de waterige 0,8% thiobarbituurzuuroplossing toe.

Breng het eindvolume in elke buis op vier milliliter door 700 microliter gedeïoniseerd water toe te voegen. Sluit de glazen buisjes stevig en incubeer ze in een verwarmingsblok ingesteld op 95 graden Celsius gedurende een uur. Bedek de buisjes met aluminiumfolie om condensvorming te voorkomen, verwijder vervolgens de buisjes uit het blok en incubeer ze gedurende 30 minuten op ijs.

Na de incubatie worden de monsters en standaarden gecentrifugeerd bij 1.500 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Breng 150 microliter supernatant van elke buis over naar een putje in een 96-wells plaat, verwijder eventuele luchtbellen met de pipettentip. Meet de absorptie van de monsters bij 532 nanometer, trek vervolgens het gemiddelde absorptieverhouding van de blanke monsters af van alle andere absorptiewaarden.

Maak een standaardcurve en gebruik deze om onbekende monsterconcentraties te berekenen. MDA bis dimethyl acetol standaardcurves werden gegenereerd om de detectielimieten en gevoeligheid van het assay en de oxidatieniveaus in drie verschillende biologische monsters te bepalen. In totaal werden 9 TBARS-assays uitgevoerd op de drie monsters op verschillende dagen.

Om de detectielimieten te bepalen, werd de absorptie van lege monsters gemeten op drie verschillende dagen. De minimale concentratie van TBARS-substantie die nodig is om een detecteerbaar niet-ruisabsorptiesignaal te geven, is 1,1 micromolair. En de gevoeligheid van het assay is ongeveer 0,0016 absorptie-eenheden per micromolair toename in concentratie.

De TBARS-assay kan worden gebruikt om veranderingen in lipideperoxidatie van verschillende biologische matrices te detecteren. Om dit aan te tonen, werd koper twee chloride gebruikt om de in vitro-oxidatie van humane serum HEPG2-cel lysaten en lagedichtheidslipoproteïnen te induceren. Een TBARS-assay werd uitgevoerd op LDL-monsters die EDTA bevatten en de niveaus van TBARS veranderden niet tussen de koper twee behandelde en onbehandelde LDL-monsters.

Echter, nadat EDTA was verwijderd door spinfiltratie, onderging LDL koper twee gemedieerde oxidatie. Om de dynamische reikwijdte van de TBARS-assay in menselijk serum te illustreren, werd een concentratie van twee millimolair koper twee ionen aan de monsters toegevoegd, wat resulteerde in een zes- tot zevenvoudige toename in TBARS. Wanneer u dit protocol probeert, laat de monsters niet langer dan 10 minuten op ijs staan en laat ze na de centrifugatie op kamertemperatuur staan.

Voor batches of subsets van biospecimens die niet oorspronkelijk samen zijn verzameld, verwerkt en bewaard, moet u de gegevens statistisch evalueren op batcheffecten om er zeker van te zijn dat artefactuele oxidatie niet heeft bijgedragen aan de resultaten. Opzettelijk kwantitatief in vitro-oxidatie van lagedichtheidslipoproteïnen maakt het mogelijk om te begrijpen hoe oxidatie het functioneren van de biologie beïnvloedt.