Een high-throughput beeldgeleide stereotactische neuronavigatie en gericht echografiesysteem voor het openen van bloed - hersenbarrière bij knaagdieren
16 juli 2020
De bloed-hersenbarrière (BBB) kan tijdelijk worden verstoord met microbubble-gemedieerde gerichte echografie (FUS). Hier beschrijven we een stapsgewijs protocol voor BBB-opening met hoge doorvoer in vivo met behulp van een modulair FUS-systeem dat toegankelijk is voor niet-echografie-experts.
Hoogwaardige gliomen zoals diffuus intrinsiek pontine glioom zijn zeer invasieve tumoren met een hoge mortaliteit. Ondanks jaren van uitgebreid onderzoek, is de bloed-hersenbarrière een belangrijk aspect omdat chemotherapie niet effectief de hersenen kan bereiken. Gelukkig is gefocuste echografie in staat om de bloed-hersenbarrière tijdelijk en lokaal te openen voor effectieve behandelingen.
We ontwikkelden een klein en kosteneffectief neuro-genavigeerd gefocust echografiesysteem voor onderbreking van de bloed-hersenbarrière. Dit systeem is gebouwd met commercieel verkrijgbare componenten en met een hoge mate van automatisering, het maakt preklinische geneesmiddelevaluatiestudies mogelijk. Precisiegeneeskunde wordt gedefinieerd als het juiste medicijn in de juiste dosis voor de juiste patiënt op het juiste moment.
Om dit te bereiken, moeten veel vooraf geselecteerde geneesmiddelen worden gescreend. Ons compacte hoge-doorvoer gefocuste echografiesysteem voor onderbreking van de bloed-hersenbarrière stelt ons in staat om precies dat te doen. De procedure zal worden gedemonstreerd door Rianne Haumann en Elvin t Hart, twee promovendi uit mijn onderzoeksgroep.
De workflow voor beeldgestuurde stereotactische neuro-navigatie gefocuste echografie omvat interventionele beeldvorming en akoestische koppeling voor sonoporatie op het echografieplatform. Daarna kan follow-up beeldvorming worden uitgevoerd. Selecteer een geschikte transducer op basis van de vereisten van het ontworpen experiment.
Plaats het in een 3D-geprinte kegel gevuld met ontgast water en sluit deze aan de onderkant af met een akoestisch transparante Mylar-membraan. Verbind de transducer met een functiegenerator en een vermogensversterker. Monteer de transducer op een gemotoriseerde lineaire stelling voor automatische verticale positionering en verbind deze met de vermogensversterker.
Gebruik een afneembaar stereotactisch platform dat temperatuurgeregelde verwarming, bijt- en oorbeugels, anesthesie en multi-modale fiducial markers omvat. Bevestig het platform aan de 2D-lineaire stelling. Voordat het FUS-systeem kan worden gebruikt, moet u het kalibreren en het focuspunt van de transducer bepalen.
Het focuspunt komt overeen met de verticale positie van het dier op het stereotactische platform. Acclimatiseer het dier gedurende ten minste één week na aankomst in de faciliteit en weeg het regelmatig. Op de dag van het experiment, dient u buprenorfine toe via een subcutane injectie 30 minuten voorafgaand aan de FUS-behandeling.
Na het anesthetiseren van de muis, breng oogzalf aan om droge ogen te voorkomen. Verwijder indien nodig het haar op de bovenkant van het hoofd van het dier met een scheermes en ontharingscreme. Was de huid met water om eventuele resten te verwijderen.
Voor experimenten met BLI-tumormodellen, injecteer 150 microliter D-luciferine intraperitoneaal met een 29 gauge insulinespuit. Voor het toedienen van microbubbels voor het openen van de BBB, plaats een 26 tot 30 gauge staartvenenkaver en spoel de ader door met een kleine hoeveelheid heparine-oplossing. Bevestig de katheter met weefselliniaal om losraken te voorkomen.
Als de katheterisatie succesvol is, vul de katheter met de heparine-oplossing om bloedstolling te voorkomen. Plaats het dier op het temperatuurgeregelde stereotactische platform om hypothermie te voorkomen. Bevestig de kop van het dier met behulp van een bijtbalk en oorbeugels en plak de staart en katheter op het platform.
Bevestig het lichaam van de muis met een riem. Plaats het stereotactische platform met de gemonteerde muis in de beeldvormingsmodaliteit en neem beelden van het dier. Bepaal of het dier correct op het platform is geplaatst.
Markeer de positie van het dier met behulp van de multi-modale fiducial markers in combinatie met de beeldverwerkingspijplijn volgens het focuspunt van de transducer. Bepaal het doelgebied door een hersencontour over de verkregen röntgenfoto te plaatsen of door BLI-beelden te gebruiken om het centrum van de tumor te bepalen. Voordat u de transducer positioneert, beschermt u de neusgaten en mond van het dier met tape om te voorkomen dat ultrasoundgel de ademhaling verstoort.
Breng ultrasoundgel aan op de kop van de muis voor goede geluidsgeleiding. Neem microbubbelcavitatie op met de naaldhydrofoon, die in de directe omgeving van het occipitale bot is geplaatst. Op basis van de kalibratiewaarden, leidt u de transducer naar de juiste positie boven het dier.
Pas vooraf geconfigureerde instellingen toe op alle aangesloten apparaten om het hersengebied van belang aan te sturen. Nadat de transducer in de juiste positie is geplaatst, lost u de microbubbels op en activeert u ze zoals beschreven door de fabrikant. Vóór het injecteren van microbubbels, spoelt u de staartvenenkaver met fysiologische zoutoplossing om de toegang tot de staartvene te bevestigen.
Start de insonicatie-traject en injecteer tegelijkertijd de microbubbels. Tegelijkertijd zal de naaldhydrofoon microbubbelcavitatie in real-time detecteren en verifiëren. Indien gewenst, dient u na sonoporatie een intravasculair contrastmiddel of geneesmiddel toe.
Bewaak het dier tot een vooraf bepaald tijdstip. Akoestische druk met een mechanische index van 0,4 in combinatie met microbubbels bleek een zeer gevoelige en betrouwbare methode voor stabiele cavitatiedetectie in vergelijking met geen detectie van subharmonische golven wanneer er geen microbubbels werden geïnjecteerd of de observatie van inertiële cavitatie wanneer een MI van 0,6 werd toegepast. Terwijl akoestische druk met een MI tot 0,6 geen macroscopisch schade veroorzaakte, werd microscopisch schade histologisch aangetoond bij een MI van 0,6.
Een drukamplitude met een MI van 0,8 resulteerde in een macroscopische hersenbloeding van grotere vaten en wijdverbreide weefselliyse met extravasatie van erytrocyten. Intraveneuze Evans blue werd geïnjecteerd om de opening van de BBB in het pontine gebied te valideren. Extravasatie van Evans blue-geconjugeerd albumine werd waargenomen op het niveau van de pons en het cerebellum bij de muis behandeld met FUS en microbubbels, wat een nauwkeurige targeting van het gebied van belang aantoonde.
De belangrijkste stappen van dit protocol zijn de juiste
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een high-throughput protocol voor de tijdelijke disruptie van de bloed-hersenbarrière (BBB) met behulp van een modulair gefocust ultrasoonsysteem (FUS). Door gebruik te maken van microbel-gemedieerde sonoporatie faciliteert deze techniek de effectieve toediening van behandelingen voor aandoeningen zoals gliomen, die worden belemmerd door de BBB. De methodologie is ontworpen voor toegankelijkheid, waardoor niet-experts in vivo opening van de BBB kunnen implementeren.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Biomedische Techniek
- Therapeutische Toediening
Achtergrond
- Hooggradige glioma's zijn zeer invasieve tumoren met beperkte behandelopties vanwege de BBB.
- Gefocuste echografie is naar voren gekomen als een veelbelovende methode voor BBB-disruptie.
- Er is behoefte aan kosteneffectieve apparaten die gemakkelijk door niet-experts kunnen worden bediend.
- Het hier beschreven protocol is erop gericht om preklinische studies voor de evaluatie van geneesmiddelen te versterken.
Doel van de studie
- Ontwikkel een high-throughput FUS-systeem voor het doorbreken van de BBB.
- Faciliteer de screening van vooraf geselecteerde geneesmiddelen voor toepassingen in de precisiegeneeskunde.
- Demonstreer de procedure effectief met behulp van een geautomatiseerd systeem.
Gebruikte methoden
- Een modulair gefocust ultrasoonsysteem werd gebruikt voor in vivo experimenten.
- Muismodellen werden ingezet om de disruptie van de BBB en de toediening van therapeutische middelen te bestuderen.
- Het proces omvat interventionele beeldvorming en akoestische koppeling voor sonoporatie.
- Cruciale stappen zijn de acclimatisatie van de dieren, het toedienen van anesthetica, catheterisatie en de nauwkeurige positionering van de ultrasoontransducer.
Belangrijkste resultaten
- De procedure demonstreerde betrouwbaar het vermogen om de afgifte van geneesmiddelen over de BBB te verbeteren.
- De detectie van microbel cavitation was essentieel voor het monitoren van de effectiviteit van de behandeling.
- Kwantitatieve resultaten bevestigden de precieze lokalisatie van de BBB-disruptie.
- Systemische effecten werden gemeten na toepassing van echografie, waarbij de veiligheid en effectiviteit werden aangetoond.
Conclusies
- Deze studie stelt een praktische en effectieve methode vast voor de disruptie van de BBB, waardoor verbeterde therapeutische interventies mogelijk worden.
- Het aanpasbare FUS-systeem biedt een basis voor verder onderzoek naar geneesmiddelentoediening en de behandeling van CNS-ziekten.
- De verkregen inzichten kunnen het begrip van precisiegeneeskunde en therapeutische targeting bij neurologische aandoeningen bevorderen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Dit high-throughput gefocust ultrasoonsysteem maakt een nauwkeurige, reproduceerbare opening van de bloed-hersenbarrière in knaagdiermodellen mogelijk, wat direct bijdraagt aan de preklinische evaluatie van geneesmiddelen voor therapeutica voor het centrale zenuwstelsel. Door beeldgestuurde stereotactische navigatie te integreren met geautomatiseerde monitoring van cavitatie, vermindert het systeem de variabiliteit en verbetert het de betrouwbaarheid van de gegevens in grootschalige screeningscampagnes. Het kosteneffectieve, modulaire ontwerp faciliteert een schaalbare implementatie in discovery-workflows die gericht zijn op glioom en andere hersenziekten.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt mechanistische analyse van de permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière mogelijk voor targetvalidatie in glioommodellen.
- Operationele waarde: Ondersteunt gestandaardiseerde, geautomatiseerde workflows die de intra-groepvariabiliteit verminderen en de reproduceerbaarheid bij studies naar target-engagement verbeteren.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt kwantitatieve, real-time detectie van cavitatie als biomarker voor een succesvolle opening van de bloed-hersenbarrière.
- Operationele waarde: Maakt high-throughput screening van vooraf geselecteerde drugcompounds mogelijk door middel van geautomatiseerde positionering van de transducer en toediening van microbubbels.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Gevalideerd in patiënt-afgeleide xenograftmodellen van glioblastoom en diffuus midline gliom, wat zorgt voor ziekterelevante preklinische modellering.
- Operationele waarde: Faciliteert risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door de bevestiging van precieze, gelokaliseerde genezindeling over de bloed-hersenbarrière.
Integratie van Pipelijns en Workflows
Het systeem integreert in het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadidentificatie, waardoor beeldgestuurde, reproduceerbare disruptie van de bloed-hersenbarrière mogelijk wordt gemaakt voor therapeutische screening.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van modulatie van de bloed-hersenbarrière in glioommodellen via nauwkeurige, stereotactische targeting.
- Screening: Maakt assays gereed via geautomatiseerde workflows, gestandaardiseerde injectie van microbubbels en real-time monitoring van cavitatie voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Genereert kwantitatieve output, waaronder cavitatiesignalen, extravasatie van Evans blue en histologische bevestiging van de opening van de barrière.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit via validatie in patiëntafgeleide glioommodellen, ter ondersteuning van therapeutische beoordelingen op basis van biomarkers.
- Enterprise Hergebruik: Opgebouwd uit commercieel verkrijgbare componenten met een modulair ontwerp, waardoor aanpassing aan meerdere onderzoeksvragen en herhaald gebruik in discovery-pipelines mogelijk is.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in gegevens over de penetratie van de bloed-hersenbarrière, waardoor mechanistische ambiguïteit bij de toediening van geneesmiddelen aan het centraal zenuwstelsel wordt verminderd.
- Operationele waarde: Zorgt voor standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid door automatisering en beeldgestuurde targeting.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door betrouwbare, kwantitatieve gegevens over de opening van de bloed-hersenbarrière te verschaffen, wat het biologische risico in een laat stadium verlaagt.
- Impact op de portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van geneesmiddelkandidaten voor het centraal zenuwstelsel mogelijk op basis van bevestigde, gelokaliseerde barrièreverstoring en geneesmiddeltoediening.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in stereotactische chirurgie, echofysica en het hanteren van microbellen.
- Vereist instrumentatie, waaronder een functiegenerator, vermogensversterker, gemotoriseerde lineaire tafel, naaldhydrofoon en beeldvormingsmodaliteiten (röntgenstraling, bioluminescentie).
- Vereist cross-team standaardisatie van de voorbereiding van dieren, catheterisatie en kalibratieprocedures van de transducer.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen aan verschillende transducerfrequenties, doelcoördinaten en modelsystemen (bijv. rat versus muis).
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak van chirurgische vaardigheid bij catheterisatie van de staartvene en potentiële variabiliteit in schedeldikte die de ultrasone transmissie beïnvloedt.
