Biomimetische replicatie van worteloppervlakmicrostructuur met behulp van wijziging van zachte lithografie
5 augustus 2020
Biomimetica is eerder gebruikt als een instrument om blad-micro-organismen interacties te bestuderen. Een dergelijk instrument bestaat echter niet voor wortels. Hier ontwikkelen we een protocol om synthetische oppervlakken te vormen die worteloppervlakmicrostructuur nabootsen voor de studie van root-omgevingsinteracties.
Dit protocol maakt het mogelijk om een synthetisch systeem te ontwikkelen dat de worteloppervlaktemicrostructuur nabootst. Het systeem kan worden gebruikt voor het bestuderen van root-omgeving interacties op een controlemanier met de nadruk op oppervlaktestructuur. Dit is een eenvoudige techniek die kan worden uitgevoerd in elk lab het bestuderen van root-omgeving interacties.
Bovendien maakt deze techniek de vorming van het oppervlak van verschillende materialen mogelijk. De moeilijkste stap is het verwijderen van de natuurlijke wortel uit de negatieve mal. Deze stap vereist een zachte behandeling van de wortel om te voorkomen dat scheuren van de wortelharen.
Visuele demonstratie zal de kijker het vermogen verbeteren om deze procedure te repliceren. Begin met het verwijderen van de plant uit de bodem na drie weken van groei. Snijd het wortelstelsel van de plant op het punt van interactie met de stengel en zet de wortelloze plant in een beker met water.
Na een paar dagen, snijd de onvoorziene wortels die uit de stengel komen en gebruik ze voor replicatie. Om zaad ontkiemde wortels te bereiden, maak je een filterpapier nat in een petrischaaltje met water en leg je verschillende M82-zaden op het papier. Broed het gerecht uit op 25 graden Celsius en hydrateer het papier elke dag.
Ongeveer vijf dagen later zullen de ontkiemende wortels lang genoeg zijn om te gebruiken voor replicatie. Bereid negatieve replica oplossing door het toevoegen van 9,49 gram diurethaan dimetharylaat aan een 50 milliliter beker. Voeg 1,45 milliliter ethylmethacrylaat toe aan de beker en bewaar bij kamertemperatuur totdat de oplossing homogeen wordt en er helder uitziet.
Voeg drie milliliter van de weekmaker toe en roer de oplossing nog een uur door. Voeg vervolgens 300 microliters van de foto initiator en roer 's nachts of totdat alle bubbels worden verwijderd. Om de negatieve replica van de wortel te genereren, neem een schone glazen schuif en giet een milliliter van de negatieve replica oplossing op.
Plaats twee tot drie wortels over de oplossing, om ervoor te zorgen dat de wortels niet volledig bedekt zijn. Houd de glijbaan gedurende acht tot tien minuten onder een acht watt ultraviolette lamp en schakel vervolgens de UV-lamp uit. Verwijder de replica van de glazen glijbaan en zet het in een petrischaal gevuld met ethanol om ongereacteerde monomeer te verwijderen.
Gebruik tangen om de wortel langzaam en voorzichtig uit de replica te verwijderen. Om de PDMS-oplossing voor te bereiden op de positieve replica, plaatst u 10 gram dimethylsiloxaan in een kopje. Voeg een gram uithardingsmiddel toe en meng goed door elkaar.
Verwarm het mengsel in een desiccator onder vacuüm gedurende twee uur om luchtbellen te verwijderen. Plaats de polyurethaan negatieve replica in een petrischaaltje en giet de PDMS mengsel op de top van de negatieve replica. Breng vacuüm gedurende twee uur aan om de dekking van de microstructuur te verzekeren en houd de petrischaal 's nachts op kamertemperatuur.
Op de volgende dag, scheid de genezen positieve replica van de negatieve replica met behulp van tangen. Om de positieve replica van ethylcellulose voor te bereiden, voeg 20 milliliter ethanol toe aan een kopje van 100 milliliter. Voeg vervolgens 1,32 milliliter weekmaker en 3,3 gram ethylcellulose toe.
En roer de oplossing bij kamertemperatuur gedurende twee uur. Giet de volgende dag de ethylcelluloseoplossing bovenop de negatieve replica in een petrischaaltje en laat de schotel 's nachts onder de motorkap staan. Verwijder vervolgens langzaam de positieve replica uit de negatieve replica met tangen.
Een goede negatieve replica kan worden gegenereerd als het protocol correct wordt gevolgd. Deze replica toont de celstructuur van het worteloppervlak en gaten die de locatie van de wortelharen vertegenwoordigen. Als de wortel wordt ondergedompeld in de polyurethaanoplossing, zal deze in het harde polymeer worden gevangen en binnen de negatieve replica blijven nadat deze is genezen.
Bij het uitharden met het UV-licht, het overschrijden van de aanbevolen uithardingstijd, zal resulteren in een extreem harde polyurethaan schimmel, waardoor het onmogelijk is om de wortel te verwijderen zonder te breken. Soms zijn de wortelstukken zo klein dat microscopie nodig is om ze te zien. Positieve replica's werden gegenereerd met PDMS en ethylcellulose.
De wortelharen bevinden zich in de rekzone waar ze beginnen te ontstaan. Hun lengtes variëren langs het worteloppervlak als ze langer worden, vergelijkbaar met de natuurlijke wortel. Sommige van de haren op de ethylcellulose replica zijn zelfs zichtbaar onder de lichtmicroscoop.
Bij het plaatsen van de wortel over de negatieve replica oplossing, is het belangrijk om de rechterkant te kiezen en te voorkomen dat de onderdompeling van de wortel in de oplossing. Deze techniek is ontwikkeld om een nieuwe weg te bieden om worteloppervlakte-interacties te onderzoeken. In het bijzonder, de fysieke krachten veroorzaakt door microstructuur en materiële eigenschappen van het oppervlak.
Overzicht
Dit protocol maakt de ontwikkeling mogelijk van synthetische oppervlakken die de microstructuur van het worteloppervlak nabootsen, wat gecontroleerde studies van interacties tussen wortels en de omgeving faciliteert. De techniek is eenvoudig en kan worden uitgevoerd in elk laboratorium dat zich richt op wortelonderzoek.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Biomimetica
- Plantbiologie
- Wortelmicrostructuur
Achtergrond
- Eerdere studies hebben biomimetica gebruikt voor interacties tussen bladeren en micro-organismen.
- Er waren geen bestaande instrumenten beschikbaar voor het bestuderen van wortelinteracties.
- Deze studie vult dit gat op door synthetische worteloppervlakken te creëren.
- Het protocol benadrukt het belang van de oppervlaktestructuur in studies naar de wortelomgeving.
Doel van de studie
- Om een synthetisch systeem te ontwikkelen dat de microstructuur van het worteloppervlak nabootst.
- Om gecontroleerde studies naar wortel-omgevingsinteracties mogelijk te maken.
- Om een reproduceerbare techniek te bieden voor onderzoekers in de plantbiologie.
Gebruikte methoden
- Extractie van wortels uit planten en bereiding van negatieve mallen.
- Gebruik van diurethaandimethacrylaat en ethylmethacrylaat voor het maken van negatieve replica's.
- Bereiding van positieve replica's met behulp van PDMS en ethylcellulose.
- Visuele demonstraties ter ondersteuning bij de replicatie van de procedure.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van negatieve en positieve replica's van worteloppervlakken.
- Replica's geven een nauwkeurige weergave van de celstructuur en de locaties van wortelharen.
- Aangetoond dat het gebruik van diverse materialen voor oppervlaktereplicatie haalbaar is.
- Inzichten verschaft in de fysieke krachten die de interacties tussen wortels en de omgeving beïnvloeden.
Conclusies
- Deze techniek opent nieuwe wegen voor onderzoek naar interacties aan het worteloppervlak.
- Het maakt gedetailleerde studies mogelijk naar de effecten van microstructuur op het gedrag van wortels.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op dit protocol om verschillende omgevingsfactoren te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Dit biomimetische platform maakt gecontroleerd onderzoek mogelijk naar de effecten van de microstructuur van het worteloppervlak op microbiële interacties, waarmee een kritische leemte in het plant-microbe-onderzoek wordt opgevuld. Door delicate wortelhaararchitecturen na te bootsen in synthetische materialen, ondersteunt deze methode het mechanistisch uitsluiten van risico's bij hypothesen over biologische processen die via het oppervlak verlopen. De benadering biedt een schaalbaar, herbruikbaar systeem voor het evalueren van de mate waarin fysieke oppervlaktekenmerken de microbiële kolonisatie en enzymsecretie beïnvloeden in discovery-workflows.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om structuur-functierelaties in wortel-microbe-interacties te onderzoeken door oppervlaktetopografie als een onafhankelijke variabele te isoleren.
- Operationele waarde: Biedt reproduceerbare synthetische oppervlakken voor consistente hypothesetoetsing over experimentele replica's heen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantificeerbare microstructurele templates voor gestandaardiseerde beoordeling van microbiële adhesie en enzymactiviteit.
- Operationele waarde: Ondersteunt materiaalveelzijdigheid (PDMS, ethylcellulose) om oppervlakte-eigenschappen af te stemmen op specifieke screeningsdoelstellingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Vergemakkelijkt het volgen van de lokalisatie van micro-organismen ten opzichte van gedefinieerde oppervlaktekenmerken, waardoor correlatie van de microstructuur met functionele resultaten zoals cellulase-secretie mogelijk is.
- Operationele waarde: Biedt een afbreekbare ethylcellulose-optie om dynamische oppervlakteveranderingen te modelleren in preklinische studies naar microbiële uitdagingen.
Integratie van pipeline en workflow
De methode bevindt zich in de fase van discovery biology, waardoor hypothesen kunnen worden gegenereerd over door oppervlakken gemedieerd microbieel gedrag voorafgaand aan compound screening of lead-optimalisatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door systematische variatie van de dichtheid van wortelharen en kenmerken van de elongatiezone mogelijk te maken om hun invloed op het microbiële gedrag te testen.
- Screening: Produceert gestandaardiseerde, reproduceerbare oppervlakken voor een hoogwaardige evaluatie van microbiële interacties onder gecontroleerde oppervlaktecondities.
- Analytics: Maakt ruimtelijke mapping van de locatie van micro-organismen ten opzichte van de oppervlaktemicrostructuur mogelijk, wat kwantitatieve op beeldvorming gebaseerde readouts verschaft voor interactiestudies.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt microstructuuranalyse in de ontdekkingsfase met preklinische validatie via biomimetische oppervlakken die de natuurlijke wortelarchitectuur weerspiegelen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een platformtechnologie die toepasbaar is op meerdere plantensoorten en microbiële systemen, waardoor redundante modelontwikkeling wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanische ambiguïteit in wortel-microbe-studies door de oppervlaktestructuur te ontkoppelen van chemische en biologische variabelen.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde vorm- en replicatieprotocollen die compatibel zijn met standaard laboratoriumapparatuur.
- Strategische waarde: Verhoogt het vertrouwen in go/no-go-beslissingen door voorspellende oppervlaktemodellen te bieden die de afhankelijkheid van variabele natuurlijke monsters verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van microbiële targets of verbindingen mogelijk op basis van structuurafhankelijke interactieprofielen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de hantering van plantenweefsel en soft-lithografie technieken voor een succesvolle vormgeneratie.
- UV-uithardingsapparatuur en een vacuümdesiccator zijn nodig voor de productie van replica's zonder luchtbellen.
- Gestandaardiseerde protocollen voor wortelvoorbereiding zijn vereist om een consistente vastlegging van de microstructuur over verschillende batches te garanderen.
- Omvat afwegingen bij de materiaalkeuze tussen de duurzaamheid van PDMS en de biologische afbreekbaarheid van ethylcellulose voor specifieke studiedoelen.
- Beperkt door de noodzaak van een voorzichtige wortelextractie om delicate haarstructuren te behouden tijdens het maken van de negatieve vorm.
Veelgestelde vragen over biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Root Preparation
1:37
Preparation of the Root Negative Replica from Polyurethane
2:47
Preparation of the Root Positive Replica from PDMS and Ethyl Cellulose
4:05
Results: Microscopy Images of Negative and Positive Replica
5:14
Conclusion
