Het bouwen van een eenvoudig en veelzijdig verlichtingssysteem voor optogenetische experimenten
12 januari 2021
Dit protocol beschrijft hoe optogenetische experimenten kunnen worden uitgevoerd voor het beheersen van genexpressie met rood en verrood licht met behulp van PhyB en PIF3. Inbegrepen zijn stapsgewijze instructies voor het bouwen van een eenvoudig en flexibel verlichtingssysteem, dat de controle van genexpressie of andere optogenetica met een computer mogelijk maakt.
Het systeem stelt onderzoekers in staat om eenvoudig een goedkoop en veelzijdig verlichtingssysteem voor optogenetische experimenten te bouwen. Voordelen van deze techniek zijn onder meer de mogelijkheid om de LED-verlichtingstiming te programmeren met beschikbare golflengten die het zichtbare nabij-IR-spectrum overspannen, en dat de LED's in verschillende contexten kunnen worden gebruikt Om een elektrisch circuit te bouwen, klemt u de printplaat op de helpende handen en plaatst u de jumperdraden, verbindt u ze om de A1- en A3-gaatjes op de grond te vormen, de D2 jumper draad in de D6 pinhole, en de voeding plus nummer zeven jumper draden in de A7 pinhole. Buig de terminals 45 graden en voeg flux toe.
Na het solderen knipt u de achterkanten van de draden bij. Steek het ene uiteinde van de gesoldeerde vrouwelijke draad naar de draadconnector in het A5-gat. Sluit vervolgens het ene uiteinde van de weerstand aan op het A5-gat.
Sluit het andere uiteinde van de connector aan op de massa. Sluit vervolgens het andere uiteinde van de weerstand aan op de massa en soldeer de verbinding. Voor de Arduino-connector krimpt u de uiteinden van de draad naar draadconnectoren en duwt u de gekrompen uiteinden door de rechthoekige connector.
Om de LED's op te zetten, kunt u een draad tin door van onderaf te verwarmen terwijl u soldeer van bovenaf toevoegt. Plaats een royale hoeveelheid soldeermiddel over de grote soldeerpunt en gebruik de punt om de LED-basis te verwarmen bij het contact met flux. Sleep na een paar seconden het soldeer individueel over elk contact en bevestig de zwarte draad op de kathode met behulp van een haarclip.
Plaats een royale hoeveelheid soldeer op de grote soldeerpunt en druk de punt op de draad totdat het soldeer op de LED-basis smelt. Houd de draad ingedrukt en verwijder de soldeerbout terwijl u de draad op zijn plaats houdt. Plaats een kleine hoeveelheid soldeerpasta op de pads voor de LED-aansluitingen en gebruik een tang om de LED over de pads te plaatsen.
Houd de voorgeklikte rode draad op de anode en gebruik een haarclip om de draad te knippen. Voeg soldeer toe aan de grote punt zoals gedemonstreerd en druk de punt op de aansluiting totdat het soldeer op de LED-basis smelt en de soldeerpasta smelt en zilver wordt. Voor het maken van de LED-draden plaatst u een krimpbuis van 4,76 millimeter over de op lengte gesneden draad en een krimpbuis van 3,18 millimeter over de draad-naar-draadconnector.
Strip en voeg flux toe aan de draaduiteinden. Gebruik de helpende handen om de draad naar de draadconnector te knippen en draai het connectoruiteinde met één draaduiteinde. Soldeer de materialen aan elkaar en bevestig de andere draad op dezelfde manier aan de opstelling en soldeer.
Klem vervolgens de LED-draden aan de helpende handen met tape onder de LED-basis. Meng vervolgens epoxy volgens de instructies van de fabrikant en verdeel de epoxy over de bovenkant van de gesoldeerde LED. Boor met behulp van de spadeboor een gat van 1,5 centimeter door de bovenkant van de doos waarop de LED wordt geplaatst en gebruik een snel roterend gereedschap om een inkeping aan één kant van het gat te maken om ruimte te maken voor de LED-draad.
Plak een stuk privacyfilm van 25 tot 30 millimeter op de zwarte doos die het gat bedekt waar de LED doorheen zal branden en plak de LED buiten de zwarte doos op het gat. Boor voor een vier LED-besturingssysteem vier gaten van 0,83 centimeter op 3,81 centimeter afstand van elkaar in het deksel van de doos en gebruik een snel roterend gereedschap om een rechthoekig gat van 1,19 bij 1,90 centimeter in de linkerbovenhoek te snijden. Boor met behulp van een spadeboor een gat van 1,5 centimeter in de achterkant van de doos en steek een grommet in het gat.
Schuur voor de computergestuurde LED's het gebied waar de microcontroller in de doos wordt gelijmd en de onderkant van de microcontrollerhouder. Klik de microcontroller op de houder en epoxy vervolgens de houder en de doos samen voordat u de houder in de zwarte doos vastzet. Plaats vervolgens dubbelzijdige tape op de clip en bevestig de clip in de doos.
In monsters die zijn getransfecteerd om fytochroom B tot expressie te brengen, maar niet fycocyanine biline, neemt de lekheid toe naarmate de hoeveelheid reporter-DNA toeneemt. Bovendien, wanneer de volledige fytochroom B-genschakelaar inclusief de phycocyanine bilin chromofour producerende plasmide wordt verlicht met ver rood licht, neemt luciferase-expressie ook toe met de toenemende hoeveelheden reporterconstructie binnen de transfectiemix. Evenzo, wanneer de lichtgevoelige cellen worden verlicht met rood licht, neemt de luciferase-expressie ook toe met een verhoogde hoeveelheid reporter.
Bij het vergelijken van inductieniveaus van de met rood licht behandelde cellen met de met rood licht behandelde cellen, wordt een kleine afname van de vouwactivering gevonden bij toenemende hoeveelheden reporter. Het is essentieel om elke stap zorgvuldig te volgen bij het bouwen van het elektrische circuit en om de pinhole-nummers regel voor regel te controleren voordat u elk onderdeel soldeert. Dit protocol kan worden gebruikt voor de optische stimulatie van vele soorten monsters of optogenetische hulpmiddelen met behulp van een verscheidenheid aan golflengten en maakt het programmeren van verlichtingsschema's mogelijk.
Overzicht
Dit protocol beschrijft de constructie van een veelzijdig verlichtingssysteem voor optogenetische experimenten, waarmee controle over genexpressie met rood en ver-rood licht mogelijk wordt gemaakt. Er worden stapsgewijze instructies gegeven voor het bouwen van het systeem en het programmeren van de LED-verlichting.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Optogenetica
- Controle van genexpressie
- Verlichtingssystemen
Achtergrond
- Optogenetica maakt een nauwkeurige controle van cellulaire functies mogelijk met behulp van licht.
- PhyB en PIF3 zijn sleutelcomponenten in de lichtgevoelige genregulatie.
- LEDs kunnen worden geprogrammeerd voor diverse verlichtingsschema's.
- Dit systeem is ontworpen om kosteneffectief te zijn en aanpasbaar voor verschillende experimentele opstellingen.
Doel van de studie
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor het construeren van een optogenetisch belichtingssysteem.
- Om onderzoekers in staat te stellen de genexpressie te controleren met specifieke golflengten van licht.
- Om het gebruik van optogenetische hulpmiddelen in diverse experimentele contexten te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Constructie van een elektrisch circuit voor LED-aansturing.
- Programmeren van de timing en golflengten van de LED-verlichting.
- Assemblage van een microcontroller voor geautomatiseerde aansturing.
- Testen van het systeem met diverse reporterconstructen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle constructie van een flexibel verlichtingssysteem.
- Verhoogde luciferase-expressie waargenomen bij hogere hoeveelheden reporter-DNA.
- Gedemonstreerde controle over genexpressie met behulp van rood en ver-rood licht.
- Systeem maakt optische stimulatie mogelijk in verschillende soorten monsters.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor optogenetische experimenten.
- Onderzoekers kunnen dit systeem gebruiken voor diverse toepassingen in genregulatie.
- Zorgvuldige naleving van het protocol garandeert succesvolle resultaten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Optogenetische controle van cellulaire pathways maakt nauwkeurige mechanistische analyse mogelijk bij targetvalidatie en fenotypische screening. Een kosteneffectief, programmeerbaar verlichtingssysteem ondersteunt reproduceerbare lichttoediening voor genexpressiestudies, waardoor de technische variabiliteit in preklinische modellen wordt verminderd. Deze aanpak vergroot het voorspellend vertrouwen door gestandaardiseerde optische stimulatie mogelijk te maken in uiteenlopende experimentele contexten.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt hypothesetoetsing van lichtgevoelige genschakelaars mogelijk om de functies van signaalpaden en het doelmechanisme te verduidelijken.
- Operationele waarde: Biedt instelbare LED-intensiteit en timing voor gecontroleerde perturbatie van signaleringspaden in cellulaire assays.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de voorbereiding van gestandaardiseerde biologische systemen voor het kwantificeren van optogenetische responsen bij verschillende chemische of genetische verstoringen.
- Operationele waarde: Faciliteert de standaardisatie van assays via programmeerbare verlichtingsschema's en golflengteselectie voor reproduceerbare resultaten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Demonstreert continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door optische stimulatie van ziekterelevante systemen met instelbare lichtparameters mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling mogelijk door dosisafhankelijke responsen op rood en ver-rood licht in assays op basis van reporters te kwantificeren.
Integratie van Pipeline & Workflow
Het verlichtingssysteem wordt geïntegreerd in discovery biology-workflows door gecontroleerde optische perturbatie van genexpressie mogelijk te maken, wat de identificatie van lead-verbindingen ondersteunt via kwantificeerbare fenotypische outputs.
- Discovery Biology: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door nauwkeurige temporele en spatiale controle van optogenetische instrumenten mogelijk te maken om de targetfunctie te onderzoeken.
- Screening: Maakt kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen mogelijk, zoals luciferase-expressie onder gedefinieerde belichtingscondities.
- Analytics: Genereert reproduceerbare lichtdosis-responsgegevens die de statistische analyse voor targetvalidatie en hitbevestiging informeren.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit door een herbruikbaar platform te bieden voor het testen van optogenetische constructen in ziektemodellen.
- Bedrijfsmatige herbruikbaarheid: Ontworpen als een schaalbare, aanpasbare capaciteit voor meerdere projecten die optische controle van cellulaire processen vereisen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in targetvalidatie door verminderde mechanistische ambiguïteit in lichtgestuurde experimenten.
- Operationele waarde: Standaardisatie en schaalbaarheid van illuminatieprotocollen over verschillende laboratoria en experimentele opstellingen.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen via betrouwbare, kwantificeerbare optogenetische read-outs die het aantal fout-positieven bij targetvalidatie verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van targets mogelijk op basis van reproduceerbare resultaten van optische stimulatie.
Overwegingen voor implementatie
- Basisbeheersing van elektronica voor de assemblage van circuits en het solderen van LED-verbindingen.
- Toegang tot Arduino-compatibele microcontrollers en soldeerinstrumentarium voor de constructie van het systeem.
- Standaardisatie van verlichtingsprotocollen tussen teams om reproduceerbare experimentele omstandigheden te waarborgen.
- Aanpassingsfactoren voor verschillende optogenetische tools die specifieke golflengten of intensiteitsbereiken vereisen.
- Praktische beperking: Handmatige kalibratie kan nodig zijn om de LED-positionering en lichtpenetratie voor specifieke monstertypes te optimaliseren.
