Verfijnde op HELDERHEID gebaseerde weefselopruiming voor driedimensionale fibroblastorganisatie in gezonde en gewonde muizenharten

Dit nieuwe weefselontruimingsprotocol verbetert de bestaande technologie om een nauwkeurigere in vivo blik te geven op specifieke celtypen in het hart en hun gedrag onder verwondingsomstandigheden. Dit protocol is snel en vrij eenvoudig. Het maakt het mogelijk om marca fluorescentie te handhaven met minimale interferentie van autofluorescentie van achtergrondweefsel zonder cel- of weefselkleuring te vereisen.

Begin met het gebruik van een 70% ethanol gedrenkt gaasje om het ventrale oppervlak van de experimentele muis te reinigen. Gebruik een chirurgische schaar om een transversale incisie van drie centimeter te maken, ongeveer drie meter onder het xiphoid-proces en de muis van de buik naar het xiphoid-proces te degloveeren om de huid van het onderliggende buikwandweefsel te scheiden. Maak een transversale incisie van twee centimeter in het onderhuidse buikwandweefsel, drie centimeter onder het xiphoid-proces en maak een verticale snede van deze incisie in de middellijn door de ribbenkast.

Speld de ribbenkast terug om het hart bloot te leggen. En gebruik een spuit van 10 milliliter uitgerust met een 27 gauge naald om koude PBS in de superieure vena cava en aorta te injecteren. Wanneer al het bloed uit het hart is gespoeld, levert u 10 milliliter koude 4% PFA in de superieure vena cava en aorta om het fixatieproces te starten.

Wanneer al het fixatief is geflitst, verwijdert u het hart en gebruikt u een rechte scalpel om de atria, rechterventrikel en septum en linkerventrikel te scheiden. Plaats het hart in een conische buis van 15 milliliter koude 4%PFA voor een nachtelijke incubatie bij vier graden Celsius op een nutator. Voeg de volgende ochtend een 0,25% foto-initiatoroplossing toe aan een vers bereide hydrogels-oplossing en breng het hart over naar de hydrogel.

Wikkel de conische buis in folie voor een nachtelijke incubatie bij vier graden Celsius zonder fysieke verstoring. Verwarm de volgende ochtend de buis in een kraalbad van 37 graden Celsius gedurende 2,5 uur voordat u een tang gebruikt om het hart voorzichtig over te brengen in een buis van 15 milliliter PBS. Was het hart driemaal in PBS gedurende één uur per wasbeurt op 37 graden celsius op een nutator en breng het hart over in de mand van een actieve elektroforesemachine.

Zet het deksel vast en vul het actieve elektroforesekamerreservoir met elektroforeseopruimingsoplossing. Zodra de kamer vol is, dompelt u de mand onder in de oplossing en draait u de dop op de elektroforesemachine vast. Laat de elektroforesemachine vervolgens 1,5 uur draaien op 1,5 ampère en 37 graden Celsius.

Controleer na elektroforese het visueel van het hart om er zeker van te zijn dat er geen ondoorzichtig weefsel achter blijft. Was het ontruimde hart driemaal in een 15 milliliter twee gedurende een uur in verse PBS op 37 graden celsius per wasbeurt op een nutator. Voordat u het hart onderdompelt in een ontkleuringsmiddel om de autofluorescentie van heem te verminderen.

Was het hart na 48 uur driemaal in PBS zoals aangetoond en equilibreert het hart in vers bereide RIM's gedurende 48 uur voorafgaand aan de beeldvorming. Voor 3D-beeldvorming van het ontruimde hart plaatst u eerst een dunne laag vacuümvet op de bodem van een 3D-geprint bodemreservoir, op dezelfde hoogte als het monster dat wordt afgebeeld. Vul het reservoir met RIMS en gebruik een pipettip om eventuele bubbels te verwijderen.

Plaats het hart voorzichtig in de RIMS met de linker ventriculaire wand naar boven gericht, zorg ervoor dat er geen bubbels in de oplossing worden geïntroduceerd. Gebruik vacuümvet om een glazen afdekstrip aan het onderoppervlak van een 3D-geprint bovenreservoirstuk te bevestigen en plaats de deksels van het bovenste reservoir op de onderste reservoirs, waarbij u ervoor zorgt dat er geen bellen ontstaan. Vul vervolgens de bovenste reservoirs met glycerol.

Gebruik een confocale microscoop om de gewiste harten in beeld te krijgen. De combinatie van verfijnde hartweefselontruiming met 3D-beeldvorming maakt een geavanceerde gedetailleerde visualisatie van hartfibroseblasten mogelijk. Met behulp van deze beeldvormingstechniek worden fibroblasten waargenomen die dicht opeengepakt zijn en een spindelmorfologie hebben in niet-gewonde harten.

Na ischemie reperfusie letsel, een verlies van cardiale fibroblasten wordt gezien in de ischemische regio voor de eerste drie dagen na letsel. Op dag zeven en 14 zijn fibroblasten gemigreerd of verspreid om het gewonde weefselgebied opnieuw te bevolken. Tegen dag 28 is de populatie van hartfibrose rond de gewonde gebieden van het hart op hun grootste dichtheid.

Anderhalve dag na myocardinfarctletsel blijven er weinig fibroblasten achter in de gewonde linkerventrikel. Op dag drie zetten de fibroblasten echter uit en zijn ze aanwezig in het grootste deel van de linkerventrikel. In tegenstelling tot ischemische chirurgie leidt infusie van angiotensine twee en fenolefrine gedurende meerdere weken niet tot hartweefselverlies en wandverdunning.

In plaats daarvan lijnt de fibroblast uit langs de as van het rechtshandige helixcontractiepatroon, zoals te zien is bij het gebruik van het protocol voor het ophelderen van geraffineerde naar weefsel. Bovendien lijken de fibroblasten na behandeling met angiotensine twee en fenolefrine klein en afgerond in tegenstelling tot de spindelvorm die wordt waargenomen bij modellen van ischemie-reprofusie en myocardinfarctletsel. De elektroforetische clearing moet zorgvuldig worden uitgevoerd, vooral bij het werken met harten die letselprotocollen hebben ondergaan.

Dit protocol kan worden gebruikt om te beoordelen hoe hartfibrose in vivo reageert op letsel. Verschillende fluorescerende markers kunnen ook worden gebruikt om te begrijpen hoe het hart reageert op letsel op cellulair niveau.