2 februari 2021
Hier presenteren we een geautomatiseerde methode voor semi-kwantitatieve bepaling van dopaminerge neuron nummer in de rat substantia nigra pars compacta.
Schatting van dopaminerge neuron nummer in de substantia nigra is een belangrijke uitkomstmaat in de ziekte van Parkinson onderzoek. Dit protocol verkort de werklast die nodig is om het neuronnummer te schatten aanzienlijk. Deze methode biedt een tijdsefficiënt en nauwkeurig proces voor het detecteren van veranderingen in het aantal dopaminerge neuronen en is geschikt voor het bepalen van het effect van interventies op de celoverleving.
Deze methode kan eenvoudig worden aangepast om nauwkeurige tellingen van neuronen in verschillende hersengebieden te bieden, terwijl de kosten- en tijdvoordelen ten opzichte van traditionele stereologische methoden behouden blijven. Om IHC-beelden vast te leggen, gebruikt u de software die is gekoppeld aan een confocale microscoop met een vergroting van 10x. Open het pingat tot 1,5 gebiedseenheden om een breed vlak van in totaal 1,5 micrometer vast te leggen en de focus op de geïnjecteerde kant van de hersenen te leggen.
Controleer op het tabblad acquisitie de optie tegelscanweergave en stel de afmetingen in op 10 bij 4. Stel onder het paneel acquisitiemodus de zoom in op 1.1 om stiksporen tussen de tegelscanafbeeldingen te voorkomen. Stel de framegrootte in op 1024 bij 1024 pixels en de gemiddelde op twee om een hoge beeldkwaliteit te garanderen.
Stel in het kanaalpaneel track één in op Alexa 488 en track twee op Alexa 555. Plaats de dia op het podium en kies een sectie met een sterke TH-kleuring. Klik live op het acquisitiepaneel.
Stel in het kanaalpaneel de lasersterkte en versterking in op niveaus die het signaal maximaliseren en het achtergrondgeluid beperken. Gebruik de bereikindicator om ervoor te zorgen dat de signalen niet overbelicht zijn. Herhaal dit met meerdere dia's.
Schakel op het tabblad Acquisitie het vakje Posities in. Om te beginnen met beeldvorming, gebruikt u het oogstuk en kiest u het eerste gedeelte met positieve TH-kleuring. Stel vervolgens de focus op het punt van belang en verplaats het podium naar de middellijn van de sectie.
Hiermee wordt de positie in de X-, Y- en Z-assen opgeslagen en wordt een tegelscan weergegeven die de hele sectie vastlegt. Herhaal dit voor alle andere dia's, inclusief een niet-geïnjecteerde site. Scheid afbeeldingsbestanden met behulp van de juiste software en importeer ze in geautomatiseerde beeldanalysesoftware.
Definieer een interessegebied door het gereedschap penannotatie te selecteren om een annotatie rond de substantia nigra pars compacta te tekenen. Ga naar het tabblad analyse en selecteer realtime afstemming in het vervolgkeuzemenu voor analyse. Dit opent een apart venster op de sectieafbeelding, zodat analyseparameters in realtime kunnen worden gewijzigd.
Selecteer onder de sectie analysevergroting de juiste beeldzoom. Selecteer onder de celdetectiesectie kernkleurstof als de kleurstof die wordt gebruikt voor TH-kleuring. Pas de nucleaire contrastdrempel, minimale nucleaire intensiteit, nucleaire segmentatieagressiviteit en nucleaire grootte-instellingen aan terwijl u het tijdafstemmingsvenster zorgvuldig bekijkt.
Herhaal dit proces met meerdere voorbeelden. Zodra een passend aantal afbeeldingen is gesampled en real-time tuning dienovereenkomstig is aangepast, slaat u de analyse-instellingen op in het vervolgkeuzemenu instellingenacties. Selecteer alle te analyseren afbeeldingen en klik op analyseren.
Kies de analyse-instelling die zojuist is opgeslagen en vink in het analysevenster het vakje annotatielagen aan, vink laag één aan en klik op analyseren. Zodra u de samenvattingsanalysegegevens voor alle secties hebt geëxporteerd, selecteert u de optie om objectanalysegegevens te exporteren. Deze dataset kan worden gebruikt om veranderingen in celgrootte te onderzoeken als reactie op een toxine of therapeutisch middel.
Zes weken na adeno geassocieerd virus of AAV injecties, stereotactische injectie van AAV uitdrukken mutant A53T alfa synucleïne in de substantia nigra in de rat hersenen resulteerde in een significante vermindering van de dichtheid van dopaminerge neuronen. Het gemiddelde aantal TH-positieve neuronen per millimeter in het kwadraat in de substantia nigra van ratten geïnjecteerd met AAV-A35T was aanzienlijk verminderd in vergelijking met dat van ratten geïnjecteerd met de AAV lege vector. Soortgelijke waarnemingen werden gedaan met behulp van onbevooroordede stereologie.
Houd er bij het proberen van dit protocol rekening mee dat de software slechts zo nuttig is als ze is opgeleid. Daarom moet er tijd en zorg worden genomen om ervoor te zorgen dat een enkele cel als één cel wordt geïdentificeerd. De software kan worden aangepast om een fluorescentie-intensiteit van andere eiwitten van belang te meten, zoals alfa-synucleïne om te bepalen of behandelingen eiwitniveaus kunnen moduleren.
Deze techniek heeft gezorgd voor een grotere efficiëntie bij het testen van het effect van meerdere potentiële therapeutische stoffen op dopaminerge neurondichtheid.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Dit artikel presenteert een gestroomlijnd protocol voor het schatten van het aantal dopaminerge neuronen in de substantia nigra, een cruciale maatstaf in preklinisch onderzoek naar de ziekte van Parkinson. De methode maakt gebruik van geautomatiseerde beeldanalyse om een nauwkeurige en tijdsefficiënte kwantificatie van tyrosine hydroxylase (TH)-positieve neuronen te bieden, wat een praktisch alternatief vormt voor traditionele onbevooroordeelde stereologische tellingen.
Nauwkeurige kwantificering van de dichtheid van dopaminerge neuronen in de substantia nigra is cruciaal voor preklinisch onderzoek naar de ziekte van Parkinson en therapeutische evaluatie. Geautomatiseerde beeldanalyse biedt een schaalbaar en tijdsefficiënt alternatief voor traditionele stereologie, waardoor een snelle beoordeling van neuroprotectieve interventies mogelijk wordt. Deze aanpak ondersteunt een robuuste validatie van targets en versnelt de besluitvorming op cruciale knooppunten tijdens de ontdekkingsfase.
Deze geautomatiseerde kwantificeringsmethode integreert processen van vroege ontdekking tot preklinische validatie en slaat een brug tussen de fasen van targetvalidatie, screening en translationeel onderzoek.