Snelle rastervoorbereiding voor tijd-opgeloste cryo-elektronenmicroscopie
6 november 2021
Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het gebruik van een apparaat voor het maken van snel rasters voor zowel snelle rasters als voor snel mengen en invriezen om tijd-opgeloste experimenten uit te voeren.
Hallo, en welkom bij deze JoVE"video. We willen u kennis laten maken met de opstelling die we hier hebben voor het snel maken van rasters, een tijdsopoeende studie die we in Leeds aan het ontwikkelen zijn. Houd er rekening mee dat dit geen standaardsysteem is, maar we hopen dat door u een gedetailleerd overzicht te geven van alle dingen en de parameters die we doen, u in staat zult zijn om vergelijkbare systemen in uw eigen laboratoria te ontwikkelen.
Een gedetailleerde beschrijving van het apparaat wordt gegeven in het Richmond-protocol. Hier gaan we een stapsgewijze handleiding geven voor snelle netvoorbereiding en tijd-opgeloste EM. In onze ervaring zou de eiwitconcentratie twee milligram per milliliter of hoger moeten zijn. Het protocol vereist een minimumvolume van ongeveer 50 microliter.
Schakel het apparaat in. Schakel vervolgens de besturings-pc in en start de besturingssoftware. Initialiseer alle spuitpompen door op de initialiseerknop op elke spuitpomp te drukken.
Schakel de voeding van de potentiometer in, stel deze in op negen volt en start de oscilloscoopbesturingssoftware. Stikstofgas onder druk is nodig om de spray te genereren. Open de stikstofcilinder en stel de druk in op 2 bar.
Zorg ervoor dat alle spuitpompkleppen in de belastingspositie staan. Om dit te doen, schakelt u alle kleppen om in de besturingssoftware te dispense en vervolgens terug om te laden. Zet alle spuiten op nul.
Alle luchtbellen in het systeem moeten in dit stadium worden verwijderd. Om dit te doen, moeten de spuiten mogelijk worden losgeschroefd, bubbels handmatig worden verwijderd en de spuiten opnieuw worden gemonteerd wanneer ze geen bubbels meer bevatten. Het vloeistofbehandelingssysteem wordt meestal opgeslagen in water.
Voordat het monster wordt geladen, wordt het systeem in evenwicht met buffer. Dit gebeurt door de slang te wassen met een teveel aan buffer. Plaats een buis met ten minste 200 microliter buffer op spuit één.
De bovenkant van de buis moet worden doorboord om deze te bevestigen. Aspirateer een geschikte hoeveelheid buffer, tussen de 50 en honderd microliter met spuit één met behulp van de besturingssoftware. Schakelklep één om af te geven.
Spuit alle vloeistof in spuit één. Terugslagklep één naar de laadpositie en druk op de initialiseerknop op spuit één om het systeem voor te bereiden op de volgende wascyclus. Deze stappen worden meestal drie keer herhaald om een grondige wassing van de slang te garanderen.
Vervolgens wordt de sproeikop geplaatst. Plaats een EM-rooster in de stortarm. Plaats het rooster voor de sproeikop.
Dispense buffer met behulp van de besturingssoftware. Als mondstuk en rooster zijn uitgelijnd, moet vloeistof zich ophopen na het spuiten gedurende een langere periode. Pas indien nodig de positie van het mondstuk aan en controleer vervolgens opnieuw waar de vloeistof zich ophoopt op het rooster.
Pas vervolgens de positie van de ethaanbeker aan. De punt van het pincet moet ongeveer tot het midden van de ethaanbeker reiken. Voer een testrun uit om er zeker van te zijn dat alle instellingen correct zijn.
Sluit de vochtigheidskamer. Zorg ervoor dat het pad van de zuiger vrij is. Aspirateer het volume buffer dat nodig is voor een enkele run in spuit één.
Schakelklep één om af te geven. Start de run door in de besturingssoftware op run'te drukken. Controleer of spuitpomp één beweegt, twee seconden in dit geval, en het rooster wordt na een passende vertraging, 1,5 seconden hier, gedompeld.
Wanneer de run is voltooid, stelt u de druk op de plunjerarm in op de gewenste waarde. Druk op OK' in de besturingssoftware om de druk van de stortarm los te laten. Nu is de ethaanbeker koel en gevuld met vloeibaar ethaan.
Gloeiend de roosters voor gebruik. Een typische gloei-ontlading is 90 seconden bij 10 milliamps in 0,1 millibar lucht. De slang wordt vervolgens in evenwicht met het monster.
Als het beschikbare monstervolume laag is, mag de buis worden gekalibreerd met slechts één dood volume. Aspiraat monster. Meestal is het dode volume ongeveer 30 microliter.
Schakelklep één om af te geven. Dispenseer het monster door middel van slangen en mondstuk. Aspirateer vervolgens de hoeveelheid monster die nodig is voor een enkele run.
Schakelklep één om af te geven. Controleer of de relatieve vochtigheid de gewenste waarde heeft bereikt. We bereiden meestal roosters voor op 60% of hoger.
Dit kan enkele minuten duren. Plaats het pincet met een gloeiend rooster in de stortarm. Plaats de potentiometerschuif in de startpositie, klaar voor snelheidsmeting.
Stel de trigger voor de snelheidsmeting in de oscilloscoopsoftware in. Plaats de vloeibare ethaanbeker en dicht bij de vochtkamer. Zorg ervoor dat het pad van de zuiger vrij is.
Start de run in de besturingssoftware. Wanneer de run is voltooid, drukt u op OK'in de besturingssoftware om de druk van de stortarm te verwijderen. Open de vochtigheidskamer, maak de verbinding tussen de plunging arm en pincet los.
Beweeg de plunging arm omhoog terwijl je het rooster in vloeibaar ethaan houdt. Breng vervolgens de roosters over naar vloeibare stikstof en in opslag. Sla de oscilloscoopmeting op.
Stel de positie van de potentiometerschuifregelaar en zuiger handmatig opnieuw in. Herhaal het protocol om replicatierasters voor te bereiden. Tijd-opgeloste experimenten worden op een vergelijkbare manier gedaan.
Hogere voorraadconcentraties zijn nodig voor tijdsopoeende experimenten vanwege verdunning in de mengstap. Gebruik voor een tijdsgeo opgelost experiment alle drie de spuiten. Slangen worden bevestigd aan de spuitpompen en aan de sproeikop.
De hier gebruikte microfluïdische sproeikop bevat ook een mengelement. Merk op dat langere buizen een groter dood volume geven en dat de evenwichtsstappen van het wassen meer buffer en monster vereisen. Alle spuiten met buffer en monster afzonderlijk in evenwicht houden.
Doorgaans wordt spuit één gebruikt voor monster A' en spuiten twee en drie worden gebruikt voor monster B'Nadat de slang in evenwicht is gebracht, laadt u monster A in spuit één en monster B in spuiten twee en drie. Schakel vervolgens de kleppen één tot drie om af te geven. Start de run in de besturingssoftware.
Houd er rekening mee dat een ander uitgevoerd script nodig is voor een experiment met een tijdsverholpen experiment. Verschillende tijdsvertragingen kunnen op twee manieren worden bereikt. Door de zuigersnelheid aan te passen, kan de tijdsvertraging van mengen tot invriezen worden gewijzigd.
Een hogere duiksnelheid zal leiden tot een kortere tijdsvertraging. Als alternatief wordt de spuitethaanafstand gewijzigd door de verticale positie van de sproeikop aan te passen. Het vergroten van de afstand zal resulteren in een langere tijdsvertraging.
In de elektronenmicroscoop bij lage vergroting ziet een typisch raster er als volgt uit. Gebieden met dun ijs, zoals aangegeven, zijn geschikt voor data-acquisitie. Bij hogere vergrotingen moeten deeltjes duidelijk zichtbaar zijn.
Bij een testexemplaar zoals apoferritine is een relatief kleine dataset van een enkel raster voldoende voor een reconstructie met een resolutie van drie tot vier angstrom. Voor tijdsopoekende experimenten verzamelen we datasets van verschillende tijdspunten of rasters. Het is handig om de gegevens voor 3D-classificatie te combineren en vervolgens deeltjes terug te traceren naar hun tijdspunten.
Op deze manier kunnen de gegevens structurele informatie en informatie over de reactiekinetiek opleveren. Tot slot hopen we dat je genoten hebt van de video. We hopen dat je met de gedetailleerde beschrijvingen in het JoVE-artikel samen met de video je eigen experimenten kunt uitvoeren via snelle rasters, waarvan is aangetoond dat het enkele van de problemen van mutatie verlicht of helpt bij interacties op de lucht-waterinterface, alles wat je nodig hebt voor het uitvoeren van je eigen tijd-opgeloste studies om te proberen enkele van die niet-evenwichtstoestanden te vangen.
Happy grid making dus.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor snelle rasterpreparatie in cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM), met de nadruk op zowel standaard snelle rasterbereiding als tijdopgeloste experimenten. De beschreven methode maakt gebruik van een eigen ontwikkeld apparaat waarmee rasterpreparatie binnen milliseconden mogelijk is, wat het vastleggen van kortlevende tussenstaten in eiwitreacties vergemakkelijkt. Het protocol is ontworpen om toegankelijk te zijn voor onderzoekers die vergelijkbare systemen willen ontwikkelen of tijdopgeloste cryo-EM-studies willen uitvoeren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM)
- Structurele biologie
- Technologie voor monstervoorbereiding
Achtergrond
- Cryo-EM ontwikkelt zich snel dankzij verbeteringen in hardware en algoritmen voor gegevensverwerking.
- Traditionele methoden voor monstervoorbereiding, zoals blotting, worden vervangen door snellere technieken zoals piëzo-elektrisch dispenseren, pin printing en direct spuiten.
- Snelle grid-preparatie is essentieel voor tijdopgeloste cryo-EM, waardoor de studie van transiënte moleculaire toestanden mogelijk wordt.
- Uitdagingen omvatten het beheersen van de ijsdikte en het optimaliseren van het monsterverbruik.
Doel van de studie
- Het bieden van een stapsgewijs protocol voor snelle en tijdopgeloste cryo-EM grid-preparatie met behulp van een aangepast apparaat.
- Het stellen van onderzoekers in staat om de methode te reproduceren of aan te passen voor hun eigen laboratoria.
- Het faciliteren van de studie naar snelle biochemische reacties door het vastleggen van intermediaire toestanden.
Gebruikte methoden
- Preparatie en initialisatie van een op maat gemaakt apparaat voor snelle grid-bereiding met spuitpompen en een microfluïdische sproeikop.
- Equilibratie van het systeem met buffer en verwijdering van luchtbellen uit de slang.
- Glow-discharge behandeling van EM-grids voorafgaand aan de monsterapplicatie.
- Precieze uitlijning van de sproeikop,Het grid en de ethaankop voor optimale bevriezing.
- Geautomatiseerde besturing van het dispenseren, spuiten en dompelen van het monster in vloeibaar ethaan.
- Tijdsopgeloste experimenten met gebruik van meerdere spuiten voor snelle menging van reactanten vóór bevriezing.
- Aanpassing van tijdsvertragingen via de snelheid van de plunjer en de positionering van de sproeikop.
Belangrijkste resultaten
- De rastervoorbereiding kan worden uitgevoerd met slechts 50 µL monster bij concentraties ≥2 mg/mL voor vier rasters.
- De vertraging tussen de monsterapplicatie en het invriezen kan zo kort zijn als 10 ms.
- Tijdsopgeloste experimenten maken het mogelijk om reactie-intermediairen vast te leggen door de vertraging tussen mengen en invriezen te variëren.
- De resulterende rasters zijn geschikt voor dataverzameling met een hoge resolutie, waarbij testmonsters reconstructies opleveren met een resolutie van 3–4 Å.
Conclusies
- Het protocol maakt een snelle en reproduceerbare cryo-EM grid-preparatie mogelijk, wat zowel standaardstudies als tijdopgeloste studies ondersteunt.
- Onderzoekers kunnen de beschreven opstelling aanpassen om hun eigen apparaten voor snelle grid-bereiding te ontwikkelen.
- Deze aanpak biedt nieuwe mogelijkheden voor het bestuderen van dynamische biologische processen met een hoge temporele en spatiale resolutie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Snelle gridpreparatie voor cryo-EM maakt het mogelijk om transiënte moleculaire toestanden vast te leggen, wat een directe impact heeft op vroege discovery en mechanistische risicoreductie in biopharma R&D. Door de tijd tussen het mengen van het monster en het invriezen te verkorten tot slechts 10 ms, ondersteunt deze aanpak structurele analyse met een hoge resolutie van kortlevende intermediairen, wat bijdraagt aan targetvalidatie en leadidentificatie. De reproduceerbaarheid en aanpasbaarheid van het protocol positioneren het als een schaalbare capaciteit voor discovery-pipelines op bedrijfsniveau.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt onderzoek naar dynamische proteïneconformaties en reactie-intermediairen mogelijk.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door het onthullen van transiënte structurele toestanden die relevant zijn voor de functie.
- Vergemakkelijkt voorspellende zekerheid over target-engagement en modulatie van signaalpaden.
Screening & assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde cryo-EM grids voor die geschikt zijn voor high-throughput structurele screening.
- Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor vergelijkende analyse tussen verschillende condities.
- Maakt snelle beoordeling mogelijk van door verbindingen geïnduceerde structurele veranderingen in eiwitten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt structurele momentopnamen uit met ziekte-relevante mechanismen voor translationele continuïteit.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde voortgang door het leveren van data met een hoge resolutie over functionele toestanden.
- Maakt integratie van structurele inzichten in de selectie van preklinische modellen en biomarkerstrategieën mogelijk.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol voor snelle rasterpreparatie is geschikt voor fasen variërend van vroege ontdekking tot lead-identificatie, en ondersteunt zowel hypothesegestuurde als screening-gebaseerde workflows in de structurele biologie.
- Discovery Biology: Versnelt het testen van hypothesen door niet-evenwichtstoestanden vast te leggen voor mechanistische helderheid.
- Screening: Biedt gestandaardiseerde, reproduceerbare grids voor downstream cryo-EM-analyse en evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Maakt kwantitatieve meting van structurele veranderingen en reactiekinetiek over verschillende tijdstippen mogelijk.
- Translationeel Onderzoek: Slaat een brug tussen ontdekking en preklinische validatie door structurele intermediairen te koppelen aan functionele resultaten.
- Enterprise Hergebruik: Biedt een modulair, aanpasbaar protocol voor diverse eiwitsystemen en experimentele ontwerpen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Standardiseert de rasterpreparatie, wat de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid tussen teams verbetert.
- Strategische waarde: Maakt betere go/no-go-beslissingen mogelijk door het leveren van structurele gegevens met een hoge resolutie en tijdsoplossing.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van structureel gevalideerde targets.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in cryo-EM instrumentatie en monsterbehandeling.
- Toegang tot microfluïdische dispensatie, nauwkeurige tijdscontroles en cryogene infrastructuur is noodzakelijk.
- Standaardisatie tussen teams is vereist voor reproduceerbare gridkwaliteit en vergelijkbaarheid van gegevens.
- Aanpasbaar aan diverse eiwitsystemen, maar optimalisatie van monsterconcentratie en ijsdikte kan nodig zijn.
- Een toegenomen ijsdikte bij hogere snelheden kan de datakwaliteit voor sommige toepassingen beperken.
