Kwantificering van cellulaire dichtheden en antigene eigenschappen met behulp van magnetische levitatie
17 mei 2021
Dit artikel beschrijft een op magnetische levitatie gebaseerde methode die specifiek de aanwezigheid van antigenen kan detecteren, oplosbaar of membraangebonden, door veranderingen in de levitatiehoogte van vanvangkralen met vaste dichtheden te kwantificeren.
Deze techniek maakt scheiding mogelijk van verschillende celtypen en cellen die verschillende processen ondergaan die uitsluitend gebaseerd zijn op dichtheid met weinig tot geen manipulatie in een korte periode van tijd. De belangrijkste voordelen van deze methode zijn dat het minimaal invasief is, kleine volumes vereist, snelle resultaten biedt, niet afhankelijk is van klassieke uitleingen en dat er geen gespecialiseerd personeel nodig is. Deze techniek kan worden toegepast voor het opsporen van meerdere ziekten, bijvoorbeeld bloedarmoede en sepsis.
Gebruik om te beginnen het prikapparaat met één klik om in de vinger van de rhesusfactor positieve bloeddonor te prikken en verzamel 10 microliter bloed in één milliliter DPBS. Voeg een microliter fluorescerende kleurstof toe in een milliliter suspensie van de rhesusfactorpositieve cellen om het plasmamembraan fluorescerend te bevlekken en incubaleer bij 37 graden Celsius gedurende 15 minuten. Pellet de cellen door gedurende 15 seconden op 5.600 maal G te draaien en was de pellet driemaal met één milliliter DPBS.
Resuspend de pellet in één milliliter HBSS met calcium en magnesium. Gebruik het prikapparaat met één klik om in de vinger van de rhesusfactor negatieve bloeddonor te prikken en twee microliter bloed te verzamelen. Om de experimentele buis met alleen kralen te bereiden, voegt u 174 microliter HBSS met calcium en magnesium, één microliter IgG-controleparels, één microliter zware kralen met een dichtheid van 1,2 gram per milliliter en 24 microliter 500 millimolar gadolinium toe.
Voeg ter voorbereiding van de experimentele controlebuis met IgG 172 microliter HBSS met calcium en magnesium, één microliter IgG-controleparels, één microliter zware kralen, één microliter rhesusfactornegatief bloed, één microliter gekleurde rhesusfactorpositieve bloedsuspensie en 24 microliter 500 millimolar gadolinium toe. Voeg ter voorbereiding van de experimentele monsterbuis 172 microliter HBSS met calcium en magnesium, één microliter anti-RhD-gecoate kralen, één microliter zware kralen, één microliter rhesusfactornegatief bloed, één microliter gekleurde rhesusfactorpositieve bloedsuspensie en 24 microliter 500 millimolar gadolinium toe. Stel het magnetische levitatieapparaat in.
En laad 50 microliter van het monster in een capillaire buis totdat de buis is gevuld. Sluit de uiteinden van de capillaire buis af met een capillaire kit om ervoor te zorgen dat er geen bubbels zijn. Plaats de capillaire buis in de capillaire houder tussen de bovenste en onderste magneten, pas het podium en de focus aan voor optimaal zicht.
Wacht ongeveer vijf tot 20 minuten totdat de cellen en kralen zich op hun magnetische evenwichtspositie hebben gevestigd. Met behulp van dit protocol werden de bloedcellen gescheiden afhankelijk van de levitatiehoogte met behulp van het magnetische levitatieapparaat. Kralen met lage en hoge dichtheid werden gebruikt om dichtheids levitatiehoogten en maatreferenties te bieden.
De polymorfinucleaire cellen zweefden boven de rode bloedcellen met een concentratie van 21 millimolaire gadoliniumionen. Oude bloedcellen zweefden bij een concentratie van 60 millimolaire gadoliniumionen. De rode bloedcellen, polymorfinucleaire cellen en lymfocyten werden gescheiden bij een concentratie van 40 millimolaire gadoliniumionen op basis van hun intrinsieke dichtheden.
Het rhesusfactorantigeen werd gedetecteerd op de rode bloedcellen met behulp van IgG en anti-RhD-antilichaam gecoate kralen. De kraalrodooscelcomplexen werden niet gegenereerd in het IgG-controlemonster, maar de fluorescerend gekleurde rode bloedcellen gevangen door de rhesusfactorpositieve kralen werden gedetecteerd. De binding van de anti-RhB aan de rhesusfactorpositieve cellen creëerde een kralencelcomplex in het centrum met intermitterende dichtheid van de ongebonden kralen en de negatieve rode bloedcellen.
Verder werd de complexe formatie bevestigd door de uitgezonden fluorescentie te observeren. De B-kraalcomplexen gevormd tussen de kralen met hoge en lage dichtheid bedekt met de antilichamen voor CR1 en CD47 wijzen op de aanwezigheid van van rode bloedcellen afgeleide extracellulaire blaasjes. Het afdekken van het capillair zonder bubbels te introduceren is de meest uitdagende stap en vereist oefening.
Deze methode zou inzicht kunnen geven voor de hematologie, met name gericht op rode bloedcelziekten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een techniek op basis van magnetische levitatie voor de specifieke detectie van antigenen in bloedmonsters, waarbij de nadruk ligt op hun dichtheidseigenschappen. De methode is effectief gebleken bij het scheiden van diverse celtypen en het identificeren van de rhesusfactor in rode bloedcellen, met minimale invasiviteit en een korte doorlooptijd.
Belangrijke studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Diagnostische technieken in de hematologie
- Scheiding van celtypen op basis van fysieke eigenschappen
- Detectie van bloedantigenen voor ziekteidentificatie
Achtergrond
- Belang van celdichtheid bij bloedanalyse
- Uitdagingen bij traditionele verwerking van bloedmonsters
- Toepassingen bij het detecteren van aandoeningen zoals anemie en sepsis
Gebruikte methoden
- Magnetische levitatie voor antigeendetectie
- Bloedmonsters van rhesusfactor-positieve en -negatieve donoren
- Fluorescente kleuring en bead-gebaseerde assays
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle scheiding van bloedcellen op basis van hun dichtheid met behulp van magnetische levitatie
- Detectie van rhesusfactorantigenen via kraalcomplexen
- Duidelijke differentiatie tussen polymorfonucleaire cellen, lymfocyten en rode bloedcellen
Conclusies
- De methode vergroot de capaciteit om bloedmonsters te analyseren met minder handelingen
- Biedt een nieuwe weg voor onderzoek naar hematologische aandoeningen
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Magnetische levitatie maakt snelle, labelvrije scheiding van cellen mogelijk op basis van intrinsieke dichtheid, wat workflows voor vroege ontdekking ondersteunt waarbij doelvalidatie en fenotypische screening minimale manipulatie vereisen. De methode biedt kwantitatieve read-outs van de aanwezigheid van antigenen via de vorming van bead-bead-complexen, wat een schaalbare aanpak biedt voor assay-ontwikkeling in ontdekkingsprogramma's gericht op hematologie. De compatibiliteit met standaard beeldvorming vermindert de afhankelijkheid van gespecialiseerde instrumentatie, waardoor de toegankelijkheid voor cross-functionele R&D-teams wordt vergroot.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door cel-subtypes te scheiden op basis van dichtheidsgerelateerde metabole en activatietoestanden.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele validatie van targets met minimale monsterverwerking, waardoor variabiliteit door manipulatiestappen wordt verminderd.
- Voorspellende waarde: Faciliteert biomarker-afgestemde stratificatie van celpopulaties om de risico's van hypothesen over target-interactie te verkleinen.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert kwantitatieve antigeenmetingen via de levitatiehoogte van bead-beadcomplexen, wat dosis-responsanalyse mogelijk maakt.
- Reproduceerbaarheid: Biedt gestandaardiseerde scheiding op basis van fysische eigenschappen, waardoor batch-tot-batchvariabiliteit in celgebaseerde assays wordt geminimaliseerd.
- Schaalbaarheid van het platform: Compatibel met beeldvorming via smartphone of tablet, ter ondersteuning van gedecentraliseerde screening en point-of-need-toepassingen.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Direct toepasbaar op hematologische ziektemodellen, waaronder anemia en sikkelcelziekte, via densiteitsgebaseerde celseparatie.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen discovery- en preklinische workflows door de natuurlijke celtoestanden tijdens de separatie te behouden.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Maakt vroege detectie van circulerende tumorcellen en extracellulaire blaasjes mogelijk, wat go/no-go-beslissingen in oncologie-pipelines ondersteunt.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het continuüm van de vroege ontdekkingsfase, waarbij zij hypothesetoetsing bij targetvalidatie ondersteunt en assay-ready systemen mogelijk maakt voor downstream screeningcampagnes.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden door cel-subpopulaties met verschillende dichtheidsprofielen die gekoppeld zijn aan de differentiatiestatus te isoleren.
- Screening: Levert kwantitatieve, op beeldvorming gebaseerde resultaten voor de evaluatie van het effect van verbindingen zonder afhankelijkheid van fluorescente of enzymatische reporters.
- Analytica: Biedt de levitatiehoogte als een meetbare output voor het vergelijken van condities en het beoordelen van targetmodulatie.
- Translationeel onderzoek: Beoudt de fenotypische integriteit van gescheiden cellen, wat continuïteit naar functionele validatie-assays ondersteunt.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Vertegenwoordigt een herbruikbaar scheidingsplatform dat toepasbaar is op meerdere targetklassen en ziektegebieden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid door mechanische ambiguïteit in celgebaseerde assays te verminderen via labelvrije scheiding.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en doorvoer via gestandaardiseerde magnetische evenwichtspositionering.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door de afhankelijkheid van reagentia en de behoefte aan gespecialiseerde training te minimaliseren.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering mogelijk door vroege detectie van zeldzame celpopulaties en antigenniveaus.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in de opstelling van magnetische levitatie en capillaire hantering om belvorming te voorkomen.
- Is afhankelijk van toegang tot instelbare magnetische velden en dichtgekalibreerde kraalensystemen.
- Vereist standaardisatie van protocollen voor kraal-antigeenkoppeling voor reproduceerbare kwantitatieve resultaten.
- Aanpassing aan niet-hematologische systemen kan optimalisatie van de kraaldichtheid en magnetische parameters vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten de gevoeligheid voor de kwaliteit van de capillaire afdichting en variabiliteit in de equilibratietijd.
