CD-spectroscopie om DNA-eiwitinteracties te bestuderen

Het protocol stelt ons in staat om de veranderingen in de tweede herstructurering van DNA geïnduceerd door ATP-afhankelijke chromatineremodelleringseiwitten te visualiseren. De verandering in de DNA-structuur kan worden gecorreleerd aan transcriptieregulatie. Dit is een eenvoudige en zeer gevoelige techniek die een zeer kleine hoeveelheid zuiver DNA gebruikt om de structurele veranderingen in het oligonucleotide vast te leggen.

Deze methode kan inzicht geven in transcriptieregulatie gemedieerd door ATP-afhankelijke chromatineremodelleringseiwitten. Bereid om te beginnen de werkconcentraties van buffers en andere reactiecomponenten vers voor en houd ze op vier graden Celsius voordat u de reacties instelt en meet vervolgens de ATPase-activiteit van het eiwit in aanwezigheid van verschillende DNA-moleculen met behulp van een NADH-gekoppelde oxidatietest. Meng 0,1 millimolar ADAAD, twee millimolar ATP, 10 nanomolair DNA en 1X REG-buffer in een 96-well plaat tot een eindvolume van 250 microliter.

Incubeer vervolgens de reactie gedurende 30 minuten in een incubator van 37 graden Celsius en meet vervolgens de hoeveelheid NAD + met behulp van de software die samen met de microplaatlezer wordt geleverd. Om de absorptie bij 340 nanometer te meten, klikt u op de NADH-test en plaatst u de 96-well plaat op de plaathouder in het instrument en klikt u vervolgens op de leesplaatknop om de absorptie te registreren. Verzamel de cd-spectra in hoogtransparante kwartscuvetten.

Gebruik rechthoekige of cilindrische cuvetten. Om de cuvetten schoon te maken, was je ze meerdere keren met water en maak je vervolgens een scan van het water of de buffer in de cuvette om te controleren of deze schoon is. Gebruik voor de reacties PAGE-gezuiverde DNA-oligonucleotiden.

Voor een snelle afkoeling verwarm je het DNA drie minuten lang op 94 graden Celsius op het verwarmingsblok en koel je het onmiddellijk af op ijs. Voor een langzame afkoeling, na het verwarmen van het DNA op 94 graden Celsius gedurende drie minuten, laat het afkoelen tot kamertemperatuur met een snelheid van één graad Celsius per minuut. Om de basisspectra vast te leggen, stelt u in totaal vijf controlereacties één voor één in 1,5 milliliter centrifugebuizen in.

Houd het reactievolume in alle reacties op 300 microliter. Om de CD-spectra vast te leggen, stelt u in totaal vijf experimentele reacties één voor één in 1,5 milliliter centrifugebuizen in. Om de scan op te nemen, zet u het gas aan en schakelt u de CD-spectrometer in.

Schakel na 10 tot 15 minuten de lamp in, schakel het waterbad in en stel de houdertemperatuur in op 37 graden Celsius. Open vervolgens de cd-spectrumsoftware en stel de temperatuur in op 37 graden Celsius, het golflengtebereik op 180 tot 300 nanometer, de tijd per punt op 0,5 seconden en het scannummer op vijf, klik vervolgens op de pro data viewer, maak een nieuw bestand en hernoem het met de details van het experiment en de datum. Meng vervolgens de basislijn- en experimentele reacties door te pipetteren en breng de reactiemengsels voorzichtig één voor één over naar de cuvette, zodat er geen luchtbellen zijn.

Als u een tijdsverloopexperiment uitvoert, incubeer dan de reacties bij 37 graden Celsius gedurende de vereiste tijd en neem vervolgens de scan. Voeg EDTA toe aan de buffer met het DNA, ATP, magnesium en eiwit om ATP-hydrolyse te stoppen. Om de ATPase-activiteit volledig te remmen, verhoogt u de EDTA-concentratie en incubatietijd.

Trek de basislijnen af van de overeenkomstige reacties in de software en maak de gegevens glad in de CD-spectrumsoftware of in de dataplotsoftware, plot vervolgens een grafiek van golflengte tegen gemiddelde residu-ellipticiteit en analyseer de pieken. M-plooien toonden aan dat beide strengen van het MYC-DNA een stengellusachtige structuur konden vormen. De M-voudige structuren van de voorwaartse en de omgekeerde DNA-sequentie met de G quadruplex GECE worden hier getoond.

De CD-spectra van snel gekoelde GECE in afwezigheid en aanwezigheid van ATP en ADAAD toonden aan dat ADAAD twee positieve pieken induceert, een bij 258 nanometer en de andere bij 210 nanometer. De toevoeging van EDTA maakt deze conformatieverandering ongedaan. De CD-spectra hebben nu een negatieve piek van 210 nanometer en een brede positieve band met pieken op 230 en 250 nanometer.

QGRS mapper en M-fold analyse toonden aan dat de promotorregio's van DROSHA, DGCR8 en DICER het potentieel hebben om G quadruplex en stem-achtige structuren te vormen. De CD-spectra van het DROSHA-paar vijf toonden aan dat ADAAD een negatieve piek induceert op 210 nanometer en een positieve piek op 260 nanometer. Dit spectrum is een kenmerk van ADNA.

De CD-spectra van DGCR8 paar één toonden een positieve piek op 210 nanometer en een brede negatieve piek op 260 nanometer. Dit spectrum is kenmerkend voor de overgang van B naar X. Voor het DGCR8-paar zeven werden sterke positieve pieken op 210 en 270 nanometer en een negatieve piek op 250 nanometer gezien.

Dit spectrum is kenmerkend voor parallelle G quadruplex DNA-structuren. Ten slotte werd voor het DICER-paar één een positieve piek op 210 nanometer en twee negatieve pieken waargenomen, één op 230 nanometer en de andere op 260 nanometer. Deze pieken zijn kenmerkend voor een A naar X DNA overgang.

Zorg ervoor dat de zuiverheid van DNA en eiwit 99% of meer is. De cuvette moet schoon zijn en de basislijn moet minder dan één millidegree zijn. Alle reagentia moeten zuiver zijn, zodat de achtergrond minder dan één millidegree is.