Cell-Edge uitsteekseldynamiek meten tijdens het verspreiden met behulp van Live-Cell Microscopie
1 november 2021
Dit protocol heeft tot doel de dynamische parameters (uitsteeksels, retracties, ruches) van uitsteeksels aan de rand van zich verspreidende cellen te meten.
Van de celranduitsteekseltest is aangetoond dat deze direct correleert met celmigratie. Daarom kan het worden gebruikt als een voorlopige methode voor het identificeren van kritieke eiwitten en signaleringsmechanismen die betrokken zijn bij de beweeglijkheid van cellen. De methode is snel, eenvoudig, kosteneffectief en vereist geen fluorescerende etikettering of het gebruik van een dure fluorescerende microscoop.
Michal Gendler, een student uit mijn laboratorium, demonstreert de procedure. Voeg twee milliliter van een normale zoutzuuroplossing toe in het midden van een glazen bodemschaal en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Was het gerecht drie keer met twee milliliter PBS.
Verdun fibronectine met een concentratie van 10 microgram per milliliter in PBS en voeg 200 microliter van de verdunde oplossing toe aan de glazen middenschaal. Incubeer gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Bereid 1% BSA-oplossing en PBS voor en voer deze door een filter van 0,2 micrometer.
Denatureer de oplossing door gedurende 30 minuten te broeden bij 70 graden Celsius in een voorverwarmd waterbad. Was de gecoate glazen bodemschaal drie keer met twee milliliter PBS. Voeg twee milliliter gedenatureerde BSA-oplossing toe en incubeer het gerecht gedurende een uur bij 37 graden Celsius.
Was de glazen schaal drie keer met twee milliliter PBS. Vóór 16 tot 18 uur experiment met 0,7 miljoen cellen per weefselkweekplaat met een diameter van 10 centimeter om 70 tot 80% confluentie te bereiken. Voeg de volgende dag twee milliliter trypsine-oplossing toe aan de weefselkweekplaat en incubeer gedurende twee tot drie minuten totdat de cellen losraken.
Voeg vijf milliliter van het medium toe om de trypsine te inactiveren. Tel met behulp van een hemacytometer de cellen en plaat 20.000 cellen in twee milliliter van het volledige medium in een onderste schaal. Incubeer vervolgens de schaal met vergulde cellen in een incubator gedurende 15 minuten.
Schakel de verwarmingseenheid in en stel deze een uur voor de beeldvorming in op 37 graden Celsius. Schakel ook de kooldioxide-eenheid in en stel deze in op 5% 10 minuten voordat u de beeldvorming uitvoert. Schakel de microscoop en camera in.
Schakel de computer in en open de microscoopacquisitiesoftware. Stel de vergroting in op een 40X droog lensfasecontrast. Stel de totale filmduur in op 10 minuten met een tijdsinterval van vijf seconden.
Plaats na 15 minuten incubatie de glazen bodemschaal met aangehechte cellen in een adapter en bevestig deze. Plaats de adapter met de schotel in de sleuven in de microscooptrap. Haal het deksel van de schotel eraf, plaats het deksel van de kooldioxide en open de kooldioxideklep.
Zoek een geschikte cel voor beeldvorming. Begin met filmacquisitie nadat je je op de cel hebt gericht. Om de beeldanalyse uit te voeren, selecteert u het rechte gereedschap in de beeldanalysesoftware en maakt u acht lijnen van 20 willekeurige eenheden loodrecht op de uitsteeksels in een radiale opstelling op elke 45 graden, inclusief lamellen en celrand.
Ga in de hoofdwerkbalk naar afbeelding, selecteer Stapels en klik vervolgens op Reslice om een kymograafafbeelding te genereren die de beweging van afzonderlijke punten in het celmembraan beschrijft. Gebruik de kymograafafbeeldingen om het aantal uitsteeksels, retracties en ruches in elk van de acht gebieden in de cel gemarkeerd door de rasterlijnen te extraheren en handmatig te tellen. Deze getallen vertegenwoordigen de frequentie van uitsteeksels, terugtrekkingen en ruches per 10 minuten.
Bepaal de uitsteeksel persistentie, afstand en snelheid door kymografie analyse. Om de uitsteekselafstand te bepalen, trekt u loodrechte lijn van de basis van het uitsteeksel naar de hoogste top van het uitsteeksel. Druk op M om de lengte van de lijn in pixels te meten en ervoor te zorgen dat de pixel-micrometerverhouding bekend is om de lengte in micrometers om te zetten.
Kwantificering van uitsteeksels, reacties en ruches werd handmatig uitgevoerd per 10 minuten en de gemiddelde frequentie verkregen voor uitsteeksels en retracties was 5,1 en 2,1 voor ruches. De representatieve kymograaf had een uitsteekselafstand van ongeveer 4,8 micrometer en een uitsteekseltijd van ongeveer 0,6 minuten. Er wordt een voorbeeld weergegeven van een cel die van de analyse moet worden uitgesloten.
Uit de kymografie-analyse bleek dat de cel niet aanwezig was in de verspreidingsfase en geen duidelijke membraanuitsteeksels vertoonde. Het belangrijkste is om de juiste cellen te kiezen voor beeldvorming. Een goede cel moet zich in de verspreidingsfase bevinden en mag andere cellen niet aanraken om cel-celcommunicatie en signalering te voorkomen.
De methode kan worden gebruikt als een voorlopig hulpmiddel voor het testen van cytoskeletale dynamica waarbij celmotiliteit betrokken is voordat wordt besloten om meer resultaten uit te voeren die celmigratietests vereisen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een celrand-protrusie-assay om de dynamische parameters van spreidende cellen te onderzoeken, waaronder protrusions, retracties en ruffles. Deze methode is bijzonder relevant omdat deze correleert met celmigratie, wat helpt bij de identificatie van kritieke eiwitten en signaleringsmechanismen die betrokken zijn bij celmotiliteit.
Belangrijkste studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Celmigratie
- Celmotiliteit
- Cytoskeletale dynamiek
Achtergrond
- Er bestaat een correlatie tussen uitstulpingen aan de celrand en celmigratie.
- De assay is eenvoudig, kostenefficiënt en vereist geen fluorescentielabeling.
- Inzicht in uitstulpingen kan informatie verschaffen over cellulair gedrag en de mechanismen die motiliteit aansturen.
Gebruikte methoden
- Cell-edge protrusie-assay
- Geadheerde cellen op een schaal met glazen bodem
- Kymografie-analyse voor het beoordelen van protrusies
Belangrijkste resultaten
- De gemiddelde frequentie van uitstulpingen was 5,1 per 10 minuten, met ruffles op 2,1.
- Kymografie-analyse onthulde een afstand van de uitstulping van ongeveer 4,8 micrometers.
- Het belang van het kiezen van geschikte cellen in de spreidingsfase voor nauwkeurige resultaten werd vastgesteld.
Conclusies
- De studie introduceert een toegankelijke assay om celmotiliteitsdynamiek te beoordelen.
- Deze methode dient als een instrument voor een voorlopige beoordeling voordat complexere migratieassays worden uitgevoerd.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
De dynamiek van celrandprotrusies dient als een vroege, voorspellende indicator voor celmotiliteit, waardoor cytoskeletregulatoren snel kunnen worden beoordeeld voordat men overgaat tot arbeidsintensieve migratie-assays. Deze methode ondersteunt targetvalidatie door moleculaire perturbaties te koppelen aan functionele membraandynamiek, wat zorgt voor mechanistische risicoreductie in discovery-workflows. Het labelvrije, kosteneffectieve ontwerp faciliteert high-throughput screening van signaleringspaden die relevant zijn voor wondgenezing, immuunrespons en kankermetastasering.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Meet de frequentie, persistentie, afstand en snelheid van protrusies om therapeutische hypothesen over actine-regulatoren en motiliteitsroutes te onderzoeken.
- Operationele waarde: Maakt snelle, labelvrije screening mogelijk van protein-knockdowns of inhibitoren die de cytoskeletdynamiek beïnvloeden.
- Voorspellende waarde: Correleert protrusiedynamiek met celmigratie, wat go/no-go beslissingen ondersteunt op basis van vroege fenotypische readouts.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve, uit kymografen afgeleide metrieken (aantal protrusies, afstand, snelheid) voor gestandaardiseerde vergelijking tussen experimentele condities.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van fasecontrastmicroscopie en toegankelijke beeldanalyse-instrumenten, waardoor de afhankelijkheid van gespecialiseerde apparatuur of fluorescerende probes wordt verminderd.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt testen onder meerdere condities via radiale bemonstering van acht membraanregio's per cel, wat de robuustheid van de gegevens verhoogt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen de modulatie van moleculaire targets en functioneel cellulair gedrag in ziekterelevante systemen, zoals fibroblasten of immuuncellen.
- Mechanistische risicoreductie: Verduidelijkt of de waargenomen fenotypische effecten voortkomen uit veranderde protrusiedynamiek in plaats van secundaire cytotoxiciteit of adhesiedefecten.
- Afstemming van biomarkers: Protrusieparameters kunnen dienen als translationele biomarkers wanneer ze gekoppeld worden aan in vivo motiliteit of invasie-fenotypes.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De assay past binnen het ontdekkingscontinuüm van target engagement tot fenotypische validatie en fungeert als brug tussen biochemische screening en functionele celgebaseerde assays.
- Discovery Biology: Test hoe genetische of farmacologische manipulaties van actine-regulatoren (bijv. Arp2/3, cofiline, Rho GTPases) de protrusiedynamiek beïnvloeden als indicator voor motiliteit.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve output (bijv. protrusies per 10 minuten, protrusiesnelheid) die vergelijking tussen verbindingenbibliotheken of genetische screens mogelijk maakt.
- Analytics: Kymografie biedt temporele en spatiale resolutie van membraandynamiek, waardoor kinetische parameters kunnen worden geëxtraheerd die cruciaal zijn voor mechanistische modellering.
- Translationeel Onderzoek: Ondersteunt de continuïteit naar preklinische modellen door te valideren dat target hits consistente protrusiefenotypes produceren in primaire of ziekterelevante cellijnen.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een gestandaardiseerd, kostenefficiënt platform voor herhaald gebruik in projecten die celmotiliteit onderzoeken bij ontwikkeling, ontsteking of oncologie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door moleculaire perturbaties direct te koppelen aan kwantificeerbare membraandynamiek.
- Operationele waarde: Elimineert de noodzaak voor fluorescente labeling en dure beeldvormingsapparatuur, waardoor de drempel voor de assay wordt verlaagd en de toegankelijkheid wordt vergroot.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door targets in een vroeg stadium te filteren met behulp van een voorspellend, fenotypisch anker voor celmigratie.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van targets mogelijk op basis van de overeenstemming tussen protrusiedynamiek en migratiepotentieel.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in live-cell imaging, het genereren van kymografen en handmatige of semi-geautomatiseerde analyse van uitstulpingen.
- Is afhankelijk van fasecontrastmicroscopie en beeldanalyse-software die in staat is tot reslicing en het genereren van kymografen.
- Vereist standaardisatie van de celzaaidichtheid, substraatcoating (fibronectine/BSA) en omgevingscontroles (37°C, 5% CO2) voor reproduceerbaarheid.
- Vereist training om geschikte cellen in de spreidingsfase te identificeren en om confluente of contacterende cellen te vermijden, aangezien deze de metingen van uitstulpingen beïnvloeden.
- Beperkt tot 2D substraat-geassocieerde spreiding; mogelijk wordt 3D-invasie of confined migration-fenotypes niet volledig vastgelegd.
