Hoge-resolutie Meting van Geur-Driven gedrag in Drosophila Larven

Hoi, mijn naam is Matt Lui. Ik ben postdoctoral fellow in het laboratorium van Leslie Sal aan de Rockefeller University. Vandaag wil ik u vertellen over de experimenten die we hebben uitgevoerd om larvale chemotaxis te bestuderen.

Het probleem waarin we geïnteresseerd zijn, is vrij eenvoudig. Het wordt hier in deze opstelling weergegeven. Ik heb zojuist een groep Joseph-larven overgebracht naar dit agar-oppervlak.

Deze omgeving is vrij vijandig en de dieren verhongeren bijna. Op de een of andere manier zullen deze dieren hun weg moeten vinden naar de dichtstbijzijnde voedselbron, en hier zijn enkele bananen die een geur verspreiden die de larven zal aantrekken. Deze omgeving is niet ideaal om chemotaxisgedrag te bestuderen, dus de eerste verbetering zal zijn om de banaan te vervangen door een chemische stof.

Deze chemische stof is iso-acetaat en het is een van de smaakstoffen die dominant aanwezig zijn in banaan. Dit is dus onze kunstmatige smaakstof en door deze te gebruiken hebben we een veel betere controle over de olfactorische stimulus. De volgende verbetering is het gebruik van een gesloten omgeving om op die manier schommelingen in de verdere verspreiding te voorkomen.

Hier is de assay die we al geruime tijd in het laboratorium gebruiken. Dit is een Petrischaal met een agarlaag op de bodem. Agar is ideaal voor chemotaxis van larven omdat het hen gehydrateerd houdt.

Aan beide zijden van de plaat bevindt zich een dop van Teflon; we gaan nu isopentylacetaat aan de ene zijde aanbrengen en aan de andere zijde geen geurstof. Zodra dit is gedaan, is het de bedoeling om de petrischaal te sluiten, een korte tijd te wachten zodat de geuren kunnen diffunderen, en daarna de schaal te openen. Plaats hier een dier en laat het dier gedurende een bepaalde periode bewegen.

Deze assay is gebaseerd op de aanname dat er door het toevoegen van theodor aan één zijde van de schaal een gradiënt ontstaat die vrijwel direct wordt vastgesteld en stabiel blijft gedurende de testperiode. Het belangrijkste probleem is echter dat niemand ooit heeft aangetoond dat deze gradiënt daadwerkelijk in de plaat aanwezig is. Het is goed mogelijk dat er kort na de toevoeging van theodor een homogene verdeling in de plaat optreedt, waardoor de gradiënt zeer gering zou zijn, of dat er meerdere minuten nodig zijn voordat de gradiënt is gevormd.

Dit zal uiteraard hoofdzakelijk afhangen van de dampdruk van het gebruikte theodor. Het tweede punt heeft betrekking op wat er tijdens het experiment wordt gekwantificeerd. Stel dat een dier hier begint, bij de X, en na drie minuten wordt aangetroffen bij deze eindplaat, de rode X. Er zijn nu twee mogelijke benaderingen.

Een mogelijkheid is om alleen de eindpositie van het dier na een bepaalde tijd, bijvoorbeeld drie of vijf minuten, te registreren. In dat geval zou u alleen de start- en eindpositie vastleggen, maar wij geloven dat het belangrijk is om een goede resolutie te hebben van het gedrag van het dier gedurende de tijd. Een dier zou bijvoorbeeld nauwelijks bewogen kunnen hebben van de startpositie naar de eindpositie, zoals hier, of het zou heel goed de regio rondom theodor gedurende een aanzienlijk deel van de tijd bezocht kunnen hebben en daarvóór het einde van de trial zijn teruggekeerd.

De conclusie die we uit deze twee situaties zouden trekken, is zeer verschillend. In het ene geval heeft het dier mogelijk niet gereageerd op de stimulus, terwijl het in het andere geval zeker wel heeft gereageerd. De twee verbeteringen die we proberen te realiseren zijn enerzijds het beheersen van de vorm en stabiliteit van de andere gradiënt in de arena.

Ten tweede volgt u het gedrag van het dier in realtime en bewaart u al deze informatie. In de volgende sequentie zal Sylvia u laten zien hoe we een seriële verdunning voorbereiden. Mijn naam is S ti.

Ik ben een onderzoeksassistent in het laboratorium van de VA die werkt aan materiaalonderzoek. Vandaag ga ik u laten zien hoe u de materialen voorbereidt voor het kamersysteem dat we gebruiken om dieren te volgen. Het belangrijkste aspect van ons kamersysteem is dat we geurstoffen gebruiken die in de lucht zijn verspreid.

Dit betekent bijvoorbeeld dat als de agarplaten die we gebruiken niet vlak zijn, er fluctuaties in de concentratie tussen experimenten kunnen optreden, wat ruis in het systeem zal introduceren. Daarom zal ik u enkele kleine tips geven om te proberen de ruis in het systeem te verminderen. De materialen voor het bereiden van uw geurverdunning zijn een glazen pot, bij voorkeur van donker glas voor het geval dat u lichtgevoelige geuren gebruikt, met een aliquot van de geur waarin u geïnteresseerd bent.

Glazen pipetten om dit aliquot voor te bereiden en een geschikte mechanische pipethulp. Daarnaast paraffine-olie pipetpunten, een standaard micropipet en kleine vials voor de verdunning. Deze laatste moeten wederom van glas zijn en bij voorkeur donkergekleurd, gevolgd door een weegschaal om nauwkeurige metingen te verrichten en ruis tussen experimenten te verminderen.

Omdat geuren zeer vluchtig zijn en sommige ervan giftig zijn, worden deze handelingen in een zuurkast uitgevoerd. De eerste stap bij het maken van een geurendilutie is het aliquoteren van de geurstof die u gaat verdunnen. Om nauwkeurige verdunningen te bereiden en de variatie tussen experimenten te minimaliseren, is het noodzakelijk om alles af te wegen.

Begin met het labelen; we gaan een ethylbutyraat-oplossing maken met een concentratie van 1 M. Bereid eerst de paraffineolie voor. Paraffineolie is zeer viskeus, dus het is belangrijk om de pipetpunt zo min mogelijk in de paraffineolie te dompelen, net genoeg om de paraffineolie op te kunnen zuigen zonder bellen te vormen.

Het is vervolgens raadzaam om het overtollige paraffineolie aan de zijkant van het flesje weg te vegen. Omdat paraffineolie viskeus is, is het opnieuw zeer belangrijk om het langzaam in het vial te laten lopen. Zodra u de paraffineolie in uw flesje heeft gepipetteerd, dient u de tip niet onmiddellijk weg te gooien, aangezien er onderin de tip nog meer olie kan samenkomen.

Het is raadzaam om voorafgaand aan het verdunnen een berekeningsblad op te stellen waarin u het volume en het gewicht van de paraffineolie die u zult toevoegen al heeft bepaald, en hetzelfde te doen voor de geurstof, inclusief het gewicht. Op die manier kunt u op de weegschaal controleren of u alle benodigde paraffineolie en geurstof aanwezig heeft. Voeg indien nodig meer paraffineolie toe en meet opnieuw tot u het juiste gewicht heeft bereikt.

Zodra u het juiste gewicht aan basisolie heeft, hoeft u alleen nog maar het geurelement toe te voegen volgens dezelfde principes. Goed. Ik ga nu laten zien hoe u larven voorbereidt voor tracking.

Meestal gebruiken we larven die zes dagen oud zijn. We doen dit omdat ze groot genoeg zijn om gemakkelijk door onze software te worden gedetecteerd en ze bovendien nog zeer actief zijn. Om vast te stellen of uw larven te oud zijn voor tracking, hoeft u alleen maar te controleren of er larven tegen de wanden opklimmen. Als er larven tegen de wand opklimmen, dan zijn ze te oud en zullen ze niet bijzonder actief zijn.

De eerste stap bij het voorbereiden van de larven is om ze onder te dompelen in 15% sucrose. De reden waarom we 15% sucrose gebruiken, is dat de larven in deze oplossing zullen drijven, terwijl het voedsel ofwel gedeeltelijk oplost of naar de bodem zinkt. Giet voldoende sucrose zodat het niveau ongeveer iets minder dan een inch onder de bovenkant van de fles of het flacon bevindt.

Neem vervolgens een spatel. De larven drijven inmiddels al naar boven; graaf voorzichtig in het voer om dieren die zich in het voer hebben gegraven los te maken, roer het geheel een beetje om om ze van het voer te scheiden en laat het vervolgens een paar minuten staan. Zodra het voer en de larven voldoende van elkaar gescheiden zijn, neemt u een vooraf gelabelde Petrischaal en giet u ze in het diepere gedeelte.

Bewaar het deksel van de petrischaal, aangezien u deze met water zult vullen en als reservoir voor de gevolgde larven zult gebruiken, zodat u kunt onderscheiden welke larven u al heeft gevolgd en welke nog niet. Nu u de larven in de petrischaal heeft gegoten, dient u 30 minuten te wachten zodat ze kunnen wennen aan de sucrose en een staat van uithongering bereiken. Dit zorgt ervoor dat ze tijdens de tracking-opstelling beter zullen reageren na deze adaptatieperiode van 30 minuten.

Tijdens de sucrose-stap is het een goed moment om de platen voor het volgen voor te bereiden. Dit zijn de bovenkanten van 96-wells platen. Deze kunnen apart worden gekocht; dit is een 3% agarose-oplossing die al is opgewarmd.

We gebruiken 3% omdat dit voorkomt dat larven graven, maar het is ook voldoende dens zodat ze erop kunnen lopen en bevochtigd blijven op elk plaatbodem. Pipetteer 25 ml agarose. Het is belangrijk om te proberen de vorming van grote bellen in de gel te vermijden.

Het is ook belangrijk om de platen op een vlak oppervlak te plaatsen, anders kunnen er gels ontstaan die schuin liggen, wat het gedrag van de larven kan beïnvloeden. Nadat de gels zijn gestold, stapelen we de bovenkanten en wikkelen we deze in vershoudfolie om uitdroging te voorkomen. Dit houdt ze gedurende enkele dagen in een goede staat voor tracking.

In deze reeks ga ik onze gedragstest presenteren, die enigszins verschilt van de petri-schaaltest waar ik eerder over sprak. U heeft hiervoor 96-wellplaten nodig, evenals platen die de agarlaag bevatten. De tests bestaan uit drie op elkaar gestapelde deksels.

De eerste lip bevat niets, is leeg en wordt alleen gebruikt om het systeem te isoleren van het oppervlak waarop het rust. De tweede laag bevat het Diego agro-oppervlak. Hier worden de dieren op het oppervlak geplaatst en nu, zoals ik u vervolgens zal laten zien, introduceren we theodor in de plaat.

Het is belangrijk om elke keer dat u de theodor vult een vers en nieuw deksel te gebruiken. Dit is om contaminatie van het ene experiment naar het andere te voorkomen. U heeft ook een andere verdunning nodig.

Normaal gesproken gebruiken we geen kleurstof om deodor te laden, maar hier zal ik het voor de illustratie wel doen. Dit is een hoge concentratie deodor. Terwijl deze zeer verdund is, is mijn doel om een gradiënt langs een lijn te creëren.

Zeg deze regel en we willen dat de concentratie van links naar rechts toeneemt. Om dit te bereiken, gebruik ik verschillende druppels in de condensatiering met een toenemende concentratie. Ik begin met de hoogste concentratie, die aan het uiteinde wordt geplaatst.

Het is belangrijk om het in de ring te verspreiden. Nu ga ik verder met de volgende concentratie, die twee keer zo sterk is verdund vergeleken met de eerste, en breng ik deze aan in deze ring. Dus nu heb ik zes druppels.

De eerste bevat een concentratie van bijvoorbeeld 1. De tweede een concentratie van 0.5, wat de helft is van de eerste. De derde heeft een concentratie van 0.25, enzovoort.

We hebben dus een meetkundige reeks langs de lijn. De volgende stap bestaat uit het omkeren van dit deksel op het AAL-oppervlak, waardoor alle druppeltjes door oppervlaktespanning aan de bovenkant van het deksel blijven hangen. We hebben een techniek ontwikkeld op basis van infraroodspectroscopie om alle concentraties in de plaat te meten.

Door deze techniek toe te passen, konden we aantonen dat wanneer er een geometrische reeks langs de geurstoffenlijn is, er een concentratie van de geurstof over de lengte ontstaat die exponentieel toeneemt, zoals hier wordt weergegeven, en over de breedte van de plaat hebben we een profiel dat piekt direct onder de geurstoffenlijn. Hier is hoe de feitelijke geometrie van de gradiënt eruitziet.

Als we kijken naar de concentratie theodor in de lucht, is het positieve aspect dat we konden aantonen dat de geometrie van de gradiënt gedurende ten minste 15 minuten stabiel blijft. Na het plaatsen van het bovenste deksel wachten we 30 seconden zodat de gradiënt kan worden vastgesteld. Vervolgens brengen we het dier in de arena.

Het dier wordt aan de andere uiteinde van de lijn tussen positie drie en vier geïntroduceerd; we gebruiken een kleine pin om de larven van de sucroseoplossing naar het agar-oppervlak over te brengen. De overdracht gebeurt door een larve rond de kop van de spijker te vissen. We openen snel het deksel en de larve wordt op het agar-oppervlak geplaatst.

Sluit vervolgens het deksel. Het is belangrijk om de tijd dat het deksel open blijft te minimaliseren. Neem daarna de beweging van het dier drie of vijf minuten lang op.

De eigenlijke opname wordt gemaakt. Met deze trackingopstelling maken we gebruik van een camera die is verbonden met een computer. De software voor beeldtracking die we gebruiken is Aton vision van Nordis om informatie over de beweging van het dier te verzamelen en deze op te slaan als een digitaal bestand.

Nu gaan we beginnen met het gedragsexperiment. We hebben het deksel met de aro-laag. We hebben de verdunningen.

Diego is vastgelopen bij het eerste dopje. Voordat theodor wordt geladen, is het belangrijk om elk vial te vortexen. We gebruiken onze verdunningen, met de laagste concentratie links en de hoogste hier rechts.

Alle zes de druppels worden tegelijkertijd op de plaat aangebracht. Om verlies van geur te voorkomen, gebruiken we hier een meerkanaals pipetteerder; van elk verdunningsmonster wordt 10 µL van de geur opgenomen en de geur wordt gelijktijdig aangebracht. Na het aanbrengen wordt het deksel nu omgedraaid op het oppervlak van de agar.

De gradiënt is in de afgelopen 30 seconden in de plaat aangemaakt, zoals ik u eerder heb laten zien. Nu ga ik een dier op het Diego-oppervlak introduceren. Zodra het dier is geïntroduceerd, start ik de opname.

Het dier is aanwezig en de beweging wordt nu gevolgd. Zoals u kunt zien, volgt het dier de geurlijn en beweegt het zich naar het punt met de hoogste concentratie van de gradiënt. Houd er rekening mee dat de concentratie van links naar rechts exponentieel toeneemt.

Zoals u kunt zien, wordt de bewegingsrichting voortdurend gecorrigeerd. Met betrekking tot de stimulus heeft het dier nu het punt met de hoogste concentratie van de gradiënt bereikt, waarna we het van de plaat verwijderen. Het dier wordt op een andere plaat geplaatst om er zeker van te zijn dat we hetzelfde individu niet direct twee keer volgen.

Nadat we een nieuwe larve hebben geïntroduceerd en een nieuwe opname zijn gestart, volgen we deze regels voor de tracking. We stoppen de tracking zodra het dier de rij met de hoogste concentratie op de plaat heeft bereikt, wat overeenkomt met deze hier, en deze hier. Daarnaast wordt de tracking onderbroken als een dier tegen de wand botst, omdat we elke interferentie willen vermijden.

De eerste vraag die we hebben behandeld was vrij eenvoudig. We wilden weten of een dier een geur bij een bepaalde concentratie kon ruiken of niet. Om een dergelijke test uit te voeren, maken we doorgaans gebruik van één enkele geurbron in plaats van meerdere.

Dit stelt u in staat om één vrijheidsgraad te hebben bij het wijzigen van de concentratie in de theodor-einddruppel. Hier heeft u bijvoorbeeld een druppel met een hoge concentratie, en hier heeft u een druppel met een lage concentratie. Wat we gewoonlijk doen, is het dier op het Diego-oppervlak direct onder de theodor-druppel introduceren om te zien of het dier in staat is de aanwezigheid ervan te detecteren en in de nabijheid ervan te blijven.

Nu wil ik een meer geavanceerde toepassing van onze assay laten zien. Stel dat u één druppel met een bepaalde orde heeft en u registreert verschillende trajecten die hier over elkaar heen zijn gelegd, en u heeft er drie. U heeft één individu dat dit groene spoor genereert.

U ziet hier dit oranje spoor dat minder gecentreerd is, en vervolgens dit roze traject dat een dier representeert dat schijnbaar rond de bron cirkelt. Wij geloven dat er veel informatie te verkrijgen is over de details van de trajecten. Om deze reden importeren we het traject als een reeks posities in Matlab en voeren we de analyse vervolgens uit met Matlab.

Hier is de afstand tot de bron, waarschijnlijk als functie van de tijd. Voor de drie trajecten die eerder werden weergegeven, ziet u het groene traject, dat zeer dicht bij de bron blijft. U ziet het oranje traject, dat aanzienlijk meer ruis vertoont.

Vervolgens ziet u deze paarse trajectorie, waaruit interessant genoeg bleek dat het dier de bron verliet om op een afstand te blijven, wat waarschijnlijk overeenkwam met een optimale concentratie. Hier ziet u de illustratie van 10 trajectorieën van dieren die niet kunnen ruiken. Dit zijn mutanten of drie B-mutanten, die non-ruikers zijn.

En zoals u kunt zien, illustreren al deze trajecten dat de dieren er niet in slaagden de bron van de geur te detecteren en deze simpelweg verlieten. Nu, in schril contrast hiermee, hebben we hier 10 opeenvolgende trajecten opgenomen voor witte ratten. Deze dieren zijn uiteraard in staat om te ruiken en, zoals u kunt zien, hopen ze allemaal zich direct onder de geurbron op.

De zojuist gepresenteerde 20 trajecten zijn in feite verkregen zonder de identiteit van de dieren te kennen. Dit demonstreert de efficiëntie en betrouwbaarheid van onze assay. Om vast te stellen of bepaalde Mutanten in staat zijn om hier een exponentiële gradiënt te ruiken, genereren we verschillende tracks om een beeld te krijgen van hoe goed de dieren in staat zijn om de stimulus aan het andere uiteinde te volgen.

Ik ga u nu 15 afzonderlijk opgenomen trajecten laten zien, en zoals u kunt zien, doen de dieren het uitstekend met het volgen van de stimulus aan het andere uiteinde van de lijn. Nu willen we verdergaan met een eenvoudige controle. Het is zeer goed mogelijk dat de dieren in de exponentiële gradiënt de lijn volgden omdat er sprake was van een stimulus, ongeacht de concentratie, en dat de dieren simpelweg in een rechte lijn bewogen.

Om dus aan te tonen dat ze inderdaad de concentratie, of iets dat daarmee samenhangt, berekenen en dit gebruiken om hun beweging te sturen, hebben we nu deze geometrie, die lijkt op een zadeldak. De larve wordt hier zoals gebruikelijk geïntroduceerd, en we verwachten dat ze langs de lijn zullen bewegen en vervolgens detecteren dat de concentratie na dit punt afneemt en er naar terugkeren. We hebben de test uitgevoerd met vijf dieren.

We hebben de trajecten verzameld en we tonen deze nu over elkaar heen geprojecteerd op deze dia. Zoals u kunt zien, zijn de dieren hier gestart, langs de lijn bewogen, vervolgens de regio met de hoogste concentratie verkend en daar hoofdzakelijk gebleven. Dit suggereert sterk dat zij in staat zijn om concentratieverschillen in realtime te berekenen met behulp van de single source assay.

We konden voornamelijk één grote vraag beantwoorden: kan een dier een geur detecteren bij een bepaalde concentratie met behulp van een apparaat met meerdere bronnen? We hebben meer flexibiliteit in het aanpassen van de vorm van de gradiënt en het bepalen of een dier in staat is om gebruik te maken van deze informatie.

Ik wil dit idee illustreren door een eenvoudig experiment uit te voeren. In de gradiënten die we tot nu toe hebben opgezet, hadden we een exponentiële vorm langs de lens. De vraag is nu of de cellen nog steeds in staat zijn hun weg naar de andere eindlijn te vinden als we ze verder uitdagen door de concentratie lineair langs de lens te laten toenemen.

Deze grafiek geeft de twee typen gradiënten weer. We hebben de exponentiële gradiënt in het paars en de lineaire gradiënt in het groen getest. Dit is de lineaire gradiënt, en ik ga de verschillende concentraties isam-acetaat opgediend in paren-olie opschrijven.

Dit is een rekenkundige reeks. Er wordt een lineaire gradiënt tot stand gebracht en, zoals u kunt zien, is de helling vrij flauw in vergelijking met de exponentiële gradiënt hier, waarbij de concentratie aan de uiteinden ook 0.5 is, maar oploopt tot 0.03. De vraag is of navi in staat zijn tot chemotaxis wanneer zij worden geconfronteerd met een dergelijke flauwe gradiënt?

Hier is de werkelijke concentratie acetaat die is gebruikt in de zes druppels voor de exponentiële gradiënt en voor de lineaire gradiënt. Zoals u kunt zien, is de laagste concentratie hier vrij hoog, hoewel de hoogste concentraties in beide gevallen voor de lineaire gradiënt gelijk zijn. We voeren het experiment uit met de lineaire gradiënt, waarbij hier 15 trajecten van wild-type dieren worden weergegeven, en we menen dat het vrij duidelijk is dat deze dieren in staat waren de lineaire gradiënt te detecteren en dit signaal langs de gradiëntlijn te volgen.

Ik denk dat ons punt hiermee duidelijk is. Voordat we hier afronden, wil ik kort ingaan op toekomstige richtingen voor deze tracking-opstelling. Hoewel deze opstelling u in staat stelt om veel interessante zaken te doen, zoals het observeren van complex gedrag bij larven over een grotere ruimte en een langere periode, kent het wel enkele beperkingen.

U bent bijvoorbeeld beperkt door de grootte van uw plaat, wat de duur van de tracking en de complexiteit van de observeerbare gedragingen limiteert. Het zou daarom wenselijk zijn om een systeem te ontwikkelen waarbij de plaat groter is of waarbij u helemaal niet beperkt wordt door de grenzen van een plaat. Een ander probleem is dat het met de huidige software moeilijk is om meer dan één dier tegelijkertijd te tracken, waardoor het niet mogelijk is om populatiegedrag in real time te observeren.

Een ander interessant aspect van het gedrag dat we met deze opstelling niet kunnen testen, zijn de feitelijke driedimensionale bewegingen van de larven in de ruimte. Wanneer u de dieren volgt, zult u zien dat ze bijvoorbeeld hun kop kunnen optillen of met hun kop heen en weer kunnen bewegen om veranderingen in de concentratie te detecteren zodra ze een geurdruppel bereiken. Mogelijk is dit met onze huidige specifieke opstelling nog niet haalbaar, dus het zou waardevol zijn om iets te ontwikkelen waarmee we dit wel kunnen doen.