Gelijktijdige beeldvorming en flowcytometrie-gebaseerde detectie van meerdere fluorescerende senescentiemarkers in therapie-geïnduceerde senescente kankercellen

Deze methode kan snel beelden met een hoge resolutie genereren die een analyse van de ruimtelijke verdeling en kwantificering van fluorescerende signalen in cellen mogelijk maken, terwijl een snelle analyse van meerdere monsters mogelijk is. Cellen worden gemeten met behulp van het geavanceerde imaging flow cytometry-systeem, waarbij snelheid, gevoeligheid en gedetailleerde eencellige beelden worden gecombineerd met ruimtelijke informatie die unieke gegevens oplevert die niet kunnen worden geleverd door flowsoptometrie of microscopie. Een belangrijk advies is om voldoende cellen te leveren om de instrumentinstellingen vast te stellen en we hangen de cellen op de hoge dichtheid voor de metingen.

Afgezien van deze data-acquisitie is eenvoudig en vergelijkbaar met conventionele flowcytometrie. Genereer eerst de DLBCL-cellijnen zoals beschreven in het manuscript. Voeg vervolgens 10 millimolaire EdU-oplossing toe in een verhouding van één tot 1000 in de DLBCL-celcultuur en incubeer de plaat in een 5% kooldioxide-incubator bij 37 graden Celsius gedurende drie uur na het mengen van de plaat door zacht schommelen.

Haal de plaat er na incubatie uit en voeg 100 millimolaire chloroquine-oplossing toe aan een uiteindelijke concentratie van 75 micromolair. Meng door zachtjes te schommelen en incubeer gedurende 30 minuten. Voeg vervolgens 20 millimol C12 FDG-oplossingen toe aan een eindconcentratie van 20 micromolair.

Na voorzichtig mengen, incubeer de plaat gedurende een uur zoals eerder aangetoond. Voeg vervolgens 100 millimolar 2-fenylethyl-bèta-d-thiogalactoside-oplossing toe aan één tot 50 om de FSA beta-gal-kleuring te stoppen. En draai de plaat voorzichtig om te mengen.

Breng de cellen over in steriele centrifugebuizen van 15 milliliter en draai gedurende vijf minuten op 100 maal G bij vier graden Celsius. Zodra het supernatant is weggegooid, wast u de cellen met vier milliliter PBS en centrifugeert u gedurende vijf minuten op vier graden Celsius op 100 maal G. Vervolgens suspensie de celpellets opnieuw in 500 microliter bij 4% paraformaldehyde fixatie-oplossing.

Na 10 minuten incubatie bij kamertemperatuur, centrifugeer op 250 maal G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg en was de cellen tweemaal met vier milliliter PBS en centrifugeer op 100 maal G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Gooi na het wassen het supernatant weg en suspensieer de celpellet opnieuw in 200 microliter saponinepermeabilisatiebuffer.

Breng nu de suspensie over op een nieuwe buis van 1,5 milliliter en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Pelleteer de cellen op 250 maal G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens suspensieer de cellen opnieuw in 200 microliter primaire antilichaamoplossing en incubeer ze 's nachts bij vier graden Celsius, in het donker.

Centrifugeer de buizen op 250 maal G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg en was met 100 microliter saponinewasoplossing. Nadat u de cellen twee keer hebt gewassen, gooit u het supernatant weg en suspenseert u de celpellets opnieuw in 500 microliter EdU-detectiecocktail.

Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten in het donker en centrifugeer bij 250 maal G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg en was met een milliliter saponine wasoplossing. Herhaal het wassen twee keer, gooi het supernatant weg en suspensieer de celpellets opnieuw in 20 tot 50 microliter PBS.

Voordat u het instrument inschakelt, leegt u de fles met afvalvloeistof en controleert u de niveaus van SpeedBeads, sterilisator, reiniger, debubbler en omhulsel voldoende vloeistoffen. Nadat u het instrument en de beeldbewerkingssoftware hebt ingeschakeld, klikt u op de opstartknop om fluidics en systeemkalibratie te initialiseren. Stel de vergroting in op 40 keer en stel de vloeistofsnelheid in op laag.

Nadat u de lasers hebt ingeschakeld, schakelt u een laser van 405 nanometer in om EdU Pacific Blue te meten, 488 nanometer om C12-FDG te meten en 642 nanometer om Alexa-Fluor-647-gamma-H2AX te meten. Stel kanaal zes in voor het strooikanaal, kanaal één en kanaal negen voor het heldere veld. Begin vervolgens met het monster waarvan wordt verwacht dat het de hoogste fluorescentie heeft om de intensiteit van de lasers in te stellen en draai de monsterbuis voorzichtig om te mengen.

Nadat u het deksel van de buis hebt geopend, plaatst u de monsterbuis op het dock. Klik op Laden om een scatter plot te starten en te openen. Selecteer vervolgens het gebied Functies, onderstreping MO1 en beeldverhouding onderstrepen MO1 voor respectievelijk de X- en Y-as.

Stel een poort boven beeldverhouding van 0,5 in om doubletten en celaggregaten onder en aan de rechterkant en de SpeedBead-populatie aan de linkerkant uit te sluiten. Open nu Histogram Plot en selecteer het functieverloopwortelgemiddelde kwadraat van masker één en kanaal één voor de X-as. Kies de singletpopulatie en stel de poort in om te selecteren op gerichte cellen.

Open een histogramplot en selecteer onbewerkte maximale pixelintensiteiten voor X-askanaal twee, zeven en 11. Pas vervolgens de laservermogens van 488 nanometer, 405 nanometer en 642 nanometer lasers aan voor respectievelijk kanaal twee, zeven en 11, zodat elke fluorochroom een ruwe maximale pixelwaarde tussen 100 en 4.000 heeft om oververzadiging te voorkomen. Kies de gerichte populatie die u wilt opnemen en klik op Verwerven om de DLBCL-monsters met consistente instellingen te meten.

Wanneer u monsters verwisselt voor meting, klikt u op terug om de monsterbuis te herstellen. Druk op Laden om het monster te verwijderen. Nadat alle monsters zijn gemeten, schakelt u de bright-field en scatter laser uit.

Meet monsters van één kleurcontrole om een compensatiematrix te genereren. Klik op Afsluiten om het beeldverwerkingssysteem te sluiten. Analyseer de gegevens in de beeldanalysesoftware.

Gebruik de Spot Wizard-tool van de beeldanalysesoftware om automatisch nucleaire gamma H2AX-foci- en live cell-afbeeldingen te tellen en te kwantificeren. Selecteer twee celpopulaties, een met hoge en een met een lage spot count om de Spot Wizard te trainen voor verdere automatische spot count analyse. De flowcytometriemethode in eencellige beelden toonde een verhoogde C12-FDG-positieve, EdU-negatieve, gamma H2AX-positieve, gesenesceerde populatie en KARPAS422.

WSU-DLCL2- en OCI-LY1-cellen, maar niet in SU-DHL6-cellen. De op beeldvorming gebaseerde analyse toonde significant hogere aantallen gamma H2AX-foci en KARPAS422, WSU-DLCL2 en OCI-LY1, maar niet in SU-DHL6-cellen. Vergelijkbare resultaten werden weergegeven door frequentie- en kwantificeringsgegevens.

Het toevoegen van saponine aan de celsuspensie is cruciaal, anders kunnen de antilichamen de interne antigenen van de cel niet bereiken en agressieve detergentia leiden tot verlies van C12-FTG-signaal Beeldvormingscytometrie is optimaal voor het analyseren van veranderingen in markerlokalisatie zoals translocatie van een transcriptiefactor naar de kern als reactie op bepaalde stimuli. Een dergelijke analyse kan ook worden bereikt met ons protocol. Deze methode maakt het mogelijk om meerdere fluorescerende markers op een enkelcellig niveau te visualiseren, wat helpt bij het detecteren van de aanwezigheid, intensiteit en lokalisatie van de individuele signalen.