Analyse van cardiale contractiele disfunctie en Ca²⁺ transiënten in knaagdiermyocyten

Deze aanpak detecteert veranderingen in contractiele functie tijdens de ontwikkeling van hartfalen. De functionele respons in myocyten op neurohormonen en potentiële therapeutische middelen kan ook worden gescreend. Het positioneren van de myocyt kan oefening vergen, maar is essentieel voor het verkrijgen van consistente beeldvorming van de sarcomeerlengte.

De procedure wordt gedemonstreerd door Margaret Westfall, universitair hoofddocent en hoofdonderzoeker van het laboratorium. Voordat u met het experiment begint, verwarmt u een gelpakket en media in een incubator gedurende 30 minuten op 37 graden Celsius. Schakel de componenten van het contractiele functieplatform in zoals vermeld in het manuscript en monteer buizen in de peristaltische pomp.

Breng vervolgens het voorverwarmde gelpakket over in de buishouder en schakel het vacuüm in de stroom naar de celstimulator in. Plaats een buis van 50 milliliter met media in de geïsoleerde buishouder om de perfusie met 0,5 milliliter per minuut door de peristaltische pompbuis te starten. Voeg vervolgens twee milliliter voorverwarmde media toe aan een kleine weegboot en breng een afdekslip met myocyten over van de stimulatiekamer naar de weegboot.

Breng de stimulatiekamer terug naar de couveuse bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Verwijder de afdekslip van de weegboot en veeg de onderkant voorzichtig af voordat u deze overbrengt naar een vers ingevette afdeksleuf en een druppel media op de afdekslip toevoegt. Plaats een platina elektrodebevestiging over de afdekslip, leg vervolgens een nieuwe afdekslip over de bovenkant met een tang en plaats een topbevestiging over de sandwich van de afdekslip.

Installeer twee of vier nummer nul panhead-schroeven om de montage van de kamer te voltooien. In de peristaltische pomp wanneer de media aanwezig is in de hele buis, bevestigt u de slang aan de voorverwarmer en de voorverwarmer aan de afdekslipkamer. Begin vervolgens met de perfusie met 0,5 milliliter per minuut en plaats een doekje onder de kamer om ervoor te zorgen dat er geen lekken zijn.

Nadat u de afdekkamer in de podiumadapter van de microscoop hebt geplaatst, schakelt u het verwarmingssysteem in en brengt u de assemblage gedurende vijf tot 10 minuten in evenwicht om een constante mediatemperatuur van 37 graden Celsius in het midden van de kamer te bereiken. Observeer de doordrenkte media die aan het andere uiteinde van de kamer worden verzameld met buizen die zijn aangesloten op een vacuümsysteem. Visualiseer tijdens de equilibratietijd myocyten met het 40x waterdompelingsobjectief op de microscoop.

Om de pacingstimulator te activeren, stelt u de spanning in op 35 tot 40 volt en past u de stimulatiefrequentie aan op 0,2 hertz om de contractiele functie en myocytenoverleving te optimaliseren. Om sarcomeerverkortingssporen te verzamelen, opent u de software op de computer en selecteert u OK, bestand en nieuwe tabbladen. Bereid een schermsjabloon voor door traceringen te selecteren, gebruikerslimieten en sarcomeerlengte te bewerken.

Neem sporen van de sarcomeerlengte op met het bestand en nieuwe tabbladen, identificeer een samentrekkende myocyt en plaats de myocyt langs de lengteas van de camera, zodat het strepenpatroon verticaal is. Gebruik de computermuis om het interessante gebied of het vak ROI over de myocyt te plaatsen. Selecteer verzamelen en begin met het opnemen van de contractiele functie.

Neem verkorting gedurende 60 seconden op van elke myocyt bij lage stimulatiefrequenties van 0,5 hertz. Registreer sarcomeer verkorting van vijf tot 10 cellen per cover slip. Om verkorting over een frequentiebereik te meten, plaatst u de myocyten op elke frequentie om steady state verkorting te verkrijgen voorafgaand aan de opname.

Verdubbel de perfusiesnelheid en begin met het opnemen van 15 tot 20 seconden na stimulatie op een nieuwe frequentie in het bereik van 0,2 tot twee hertz en registreer niet meer dan twee myocyten per coverslip voor verkorting over het gegeven bereik van stimulatiefrequenties. Registreer ten minste zeven contracties per cel om betrouwbare signaalgemiddelde gegevens te verkrijgen. Selecteer het bestand, kies een opgenomen tracering en selecteer vervolgens openen.

Selecteer tab een van de basistracering en stel vervolgens het gele paneel boven aan de trace in om de sarclengte te verkrijgen. Bereid een analysesjabloon voor met monotone transiënte analyseopties voor bewerkingen en TTL-gebeurtenismarkering in het vak T Nul in de benodigde opties in het menu. Sla deze analyseopties op door sjablonen te selecteren en sla de analysesjabloon op met een id.

Laad de analysesjabloon voordat u elke tracering analyseert. Als u de gegevens wilt analyseren, selecteert u markeringen, gate, voegt u transiënt toe en converteert u vervolgens van gebeurtenismarkering en analysebereik. Stel het tijdsbereik in van min 0,01 tot 1,20 seconden voor myocyten met een tempo van 0,2 hertz.

Selecteer een korter tijdsbereik voor myocyten gestimuleerd op hogere frequenties. Selecteer bewerkingen en gemiddelde gebeurtenissen om een signaalgemiddelde opname onder de oorspronkelijke basistracering te produceren. Selecteer vervolgens tab een van de signaalgemiddelde tracering en ga vervolgens naar markeringen in het bovenste menu, gevolgd door transiënt toevoegen, operaties en monotone transiënte analyse kiezen om de signaalgemiddelde waarden voor baseline-sarcomeerparameters weer te geven in het signaalgemiddelde weergavepaneel.

Selecteer monotone transiënte analyse en klembordstroom exporteren en transiënte sarcomeeranalyse overbrengen naar een spreadsheet voor de samengestelde analyse van meerdere myocyten. Als u de signaalgemiddelde tracering wilt kopiëren, selecteert u export, huidige tracering en vervolgens klembord- en optietabbladen in volgorde en stelt u de decimalen in op vijf. Kies het scheidingsteken voor tabbladen en klik op OK.

Breng de signaalgemiddelde sporen voor elke myocytopname in een tweede spreadsheet. De studie toonde aan dat de drukoverbelasting of PO de contractiele functie van de myocyten verminderde in vergelijking met de schijngroep. Vier dagen na de genoverdracht van cardiale troponine IT 144D of cTnIT144D keerde het contractiele vermogen in de PO-myocyten echter terug naar schijnniveaus, wat aangeeft dat de myocytenfunctie kon worden hersteld.

In de eerste studies verbeterde de genoverdracht van cTnIT144D de piekverkorting en verhoogde diastolische calciumspiegels in vergelijking met CTnI. Fijne aanpassingen in de positionering van de cardiale myocyt zijn vaak nodig om duidelijke verkortingssporen te verkrijgen. Dit protocol kan ook worden uitgevoerd op cardiale myocyten geladen met calciumgevoelige fluorescerende kleurstoffen zoals Fura-2 AM om calciumtransiënten te detecteren naast verkorting.