AMEBaS: Automatische middellijnextractie en achtergrondaftrekking van ratiometrische fluorescentie-time-lapses van gepolariseerde afzonderlijke cellen

Deze methode kwantificeert de spatiotemporele dynamiek van gepolariseerde cellen langs de middellijn die fluorescerende reporter of kleurstof tot expressie brengt voor specifieke entiteiten van belang, zoals actine, ionen of blaasjesdynamiek. De versie van automatisering elimineert vooroordelen en maakt schaalbaarheid mogelijk, vooral voor taken die handmatig digitaal worden uitgevoerd en tijdrovend en subjectief kunnen worden. Open om te beginnen Jupyter Notebook en lees de time-lapse-bestanden, hetzij door naar de startpagina van de interactieve notebook van Google CoLab te gaan, hetzij door de AMEBaS_local IP YNB van GitHub te downloaden en te openen.

Om de directory-instelling voor te bereiden op de invoer- en uitvoergegevens met behulp van de lokale versie, plaatst u de fluorescentie-time-lapse als een TIF- of DV-bestand in een map met de naam gegevens die zich in de hoofdmap van het programma bevindt. Maak een map uit om de gegenereerde gegevens te ontvangen en voer vervolgens het installatiecodeblok uit. Als u het notitieblok op Google CoLab gebruikt, voert u het installatiecodeblok uit om automatisch gegevens en mappen uit te genereren en voert u vervolgens het codeblok voor bestandsinvoer uit om de time-lapse-gegevens te lezen door op de afspeelknop te klikken.

Als u Google CoLab gebruikt, uploadt u het time-lapse-bestand naar de gegevensmap door op de knop Bestand kiezen te klikken. Kies er vervolgens voor om voor elke stap extra uitvoer te genereren door de uitgebreide parameter in te stellen op waar of onwaar. Als u de hoofdcel en het segment vanaf de achtergrond wilt detecteren, voert u het codeblok voor segmentatie met één cel uit door op de afspeelknop te klikken om de gewenste cel automatisch van de achtergrond te scheiden.

Pas de sigma-waarde in de sigma-variabele aan om de vloeiendheid van het segmentatiemasker te verfijnen. De standaardwaarde is 2.0. Stel nu de variabele schatting in op false voor het opslaan van de drempelwaarde die rechtstreeks op basis van de ISO-gegevens wordt geschat, of true voor het afvlakken van de drempel over aangrenzende frames met behulp van lokale polynomiale regressie.

Pas de variabele n_points aan om de functie te verfijnen met een standaardwaarde van 40. Om de middellijn langs de celextensie te traceren, voert u het codeblok voor het traceren van de celmiddellijn uit door op de afspeelknop te klikken om de cel te skeletteren met behulp van Lee's methode en de punt van het laatste skelet uit te breiden door middel van lineaire extrapolatie. Selecteer vervolgens de overtrekoptie voor de middellijn door het argument complete_skeletonization aan te passen om over te trekken op het laatste frame of eenmaal per frame.

Pas de variabele interpolation_fraction aan om de fractie van punten in het skelet in te stellen voor interpolatie tijdens extrapolatie. De standaardwaarde hier is 0,25. Wijzig vervolgens de extrapolation_length variabele om de lengte van de middellijnextrapolatie te bepalen.

De standaardwaarde is min één, waardoor het skelet zich uitstrekt tot aan de dichtstbijzijnde rand. Voer nu het eerste codeblok voor gegevensvisualisatie uit door op de afspeelknop te klikken om automatisch kymografen voor beide kanalen te genereren. Kies de Gaussiaanse kernelgrootte voor afvlakking door de variabele kymograph_kernel aan te passen.

Om de intensiteiten van niet-verlengde skeletten goed weer te geven, is een aangepaste kleurenkaart nodig voor hun afgedekte kymografen. Pas de variabele shift_fraction aan om het fractiepercentage van de intensiteiten te kiezen dat wordt aangeduid als de achtergrondkleur, zwart. Voer vervolgens het tweede codeblok voor gegevensvisualisatie uit door op de afspeelknop te klikken om automatisch een verhouding, metrische kymograaf en time-lapse te genereren.

Pas de variabele switch_ratio aan om de volgorde van de kanalen te wijzigen die worden gebruikt als teller en noemer tijdens verhoudingsberekeningen, waarbij de standaardwaarde onwaar is. Controleer of het tijdsverloop van de verhouding extra moet worden afgevlakt met een mediane filterdoorgang door de smooth_ratio variabele aan te passen. Standaard is dit ingesteld op false.

Kies er vervolgens voor om uitschieters als gevolg van een laag signaal in het noemerkanaal te verwijderen of te behouden door de reject_outliers variabele aan te passen. Uitschieters worden gemarkeerd als waarden die 1,5 keer zo groot zijn als de interkwartielafstand boven het derde kwartiel. Kies ten slotte of de achtergrond en de verhouding metrische uitvoer moeten worden geëxporteerd door de variabele background_ratio aan te passen.

De standaardinstelling is false om de achtergrond te vervangen door nullen. AMEBaS getest op datasets zoals stuifmeelbuisjes die de calciumreporter cameleon tot expressie brengen, pollenbuisjes die de pH-indicator florine tot expressie brengen, wortelharen die de calciumreporter NESYC 3.6 tot expressie brengen, werkten met succes ondanks verschillen in de groeirichting, beeldvormingstechnieken, fluorescerende reporters en celtypen. Vergeet niet om de set blokken uit te voeren, zodat u de vereiste pakketten kunt installeren.

Bovendien is het van cruciaal belang om de sigma-waarden specifiek voor uw afbeeldingen aan te passen, zodat u nauwkeurigere resultaten kunt krijgen. De resulterende kymografen kunnen vervolgens worden gebruikt om de spatiotemporele dynamiek van het oplossingsbelang te analyseren. Bovendien kunt u het vinden van methode, groei en tijdreeksen berekenen om de juiste oplossing te analyseren.