Optimalisatie van het monstervoorbereidingsproces voor transmissie-elektronenmicroscopie van neuromusculaire juncties in Drosophila-larven

De diffuse verdeling en het beperkte visuele bereik van de TEM vormen een uitdaging voor de infrastructurele analyse. Dit protocol presenteert een innovatieve en efficiënte methode voor monstervoorbereiding die de conventionele aanpak overtreft. Deze geavanceerde methode van TEM-monstervoorbereiding is effectiever in het voorkomen van het krullen van de monsters in vergelijking met de traditionele methode door de monsters plat te laten blijven tijdens de daaropvolgende uitdroging.

De keuze van de reagentia en de aanpassing van de dosering moeten noodzakelijk zijn, afhankelijk van het type monster. Er worden veel giftige chemische reagentia gebruikt in het monstervoorbereidingsproces. De procedure zal worden gedemonstreerd door Sheng Qingyuan, een masterstudent van het laboratorium van Dr. Gan Guangming.

Ontleed om te beginnen de zwervende larven van de late derde instar Drosophila in Jan-oplossing en verkrijg de volledige lichaamswand volgens de standaardprocedures. Fixeer de larvale lichaamswand met het fixeermiddel 's nachts in de dissectiekamer bij vier graden Celsius. Breng de volgende dag de lichaamswand van de larve over van de dissectiekamer naar een centrifugebuis van 1,5 milliliter en spoel deze meerdere keren met natriumcacodylaatbuffer.

Fixeer de lichaamswand van de larve gedurende twee uur in 1%osmiumtetroxide. Was de monsters na fixatie meerdere keren met gedestilleerd water. Voeg 2% verzadigde urinoiracetaatoplossing toe aan de tube om de PHI-neuromusculaire overgang te kleuren.

En spoel de monsters na twee uur af met gedeïoniseerd water. Knip vervolgens met een schaar twee ronde stukken metalen gaas met een poriegrootte van 270 micron. Plaats het metalen gaas op de bodem van een fles met platte bodem.

Plaats vervolgens de vaste larven op het gaas, gevolgd door het plaatsen van een ander gaas. Dehydrateer de monsters in een toenemende ethanolconcentratie gedurende 20 minuten elk bij vier graden Celsius. Spoel de monsters vervolgens twee keer af met propyleenoxide bij kamertemperatuur gedurende telkens vijf minuten.

Plaats de monsters vervolgens in een oplossing van propyleenoxide en epoxyhars, gevolgd door pure epoxyhars gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Snijd voor het inbedden een polyethyleenfilm in een groot vierkant en een kleine, holle rechthoekige steun. Lijm het kleine vierkant met het grote vierkant.

Voeg voldoende epoxyhars toe in het midden van het grote plein. Zet vervolgens de stereoscoop aan en plaats de monsters in de voorgepositioneerde epoxyhars met de spierkant naar boven. Voeg enkele druppels epoxyhars toe aan de monsters en bedek ze met polyethyleenfilm.

Plaats de polymerisatiemonsters elk 24 uur bij toenemende temperaturen. Verwijder na polymerisatie met een scherp mes de overtollige delen van het larvale lichaam met behoud van een trapezium, inclusief het A2- en A3-segment. Verwijder het trapezium van de resterende wand van het larvale lichaam en bevestig het met AB-lijm aan de met hars gevulde capsule.

Bevestig onder een lichtmicroscoop de positie van de zesde en zevende spier van de A2- en A3-segmenten, waarbij het raakvlak evenwijdig aan de zesde spier wordt gehouden. Snijd vervolgens een vijfde van het monster weg langs de twee zijden van het A3-segment. Bereid met behulp van een microtoom een ultradun deel van het monster voor, beginnend bij de zesde spier.

Bevestig na het snijden zoveel mogelijk plakjes aan elk koperen gaas. Gebruik een transmissie-elektronenmicroscoop om de monsters te observeren. Onder Lowicryl K4M-hars en epoxyhars zorgde Lowicryl K4M-hars voor scherpere en gemakkelijker waarneembare resultaten van de Drosophila-lichaamsspieren.

Confocale beeldvorming toonde een verbeterde visualisatie van de neuromusculaire verbinding tussen de zesde en zevende spier. Transmissie-elektronenmicroscopie onthulde kraalachtige neuromusculaire knooppunten, die verbeterde informatie over de synaptische structuur boden. De monsters bleven tijdens het uitdrogingsproces plat vanwege de beperking van de metalen mazen.

Bovendien werden de monsters gepolymeriseerd tussen de plastic producten, waardoor de monsters niet konden vouwen. In de toekomst kan de TEM-monstervoorbereidingsmethode worden toegepast op neuropil van de hersenen en het ventrale zenuwkoord, waardoor het potentieel van ultrastructureel onderzoek wordt verbeterd.