Multiplex immunofluorescentie gecombineerd met ruimtelijke beeldanalyse voor de klinische en biologische beoordeling van de micro-omgeving van de tumor
2 juni 2023
In dit artikel wordt een protocol beschreven voor handmatige tyramide signaalversterking (TSA) multiplex immunofluorescentie (mIF) in combinatie met beeldanalyse en ruimtelijke analyse. Dit protocol kan worden gebruikt met formaline-vaste paraffine-ingebedde (FFPE) secties voor de kleuring van twee tot zes antigenen per dia, afhankelijk van de diascanner die beschikbaar is in het laboratorium.
In ons lab bestuderen we menselijke colorectale kanker. De progressie naar gemetastaseerde ziekte en de reactie op de behandeling, inclusief immunotherapie. We proberen nieuwe voorspellende en prognostische biomarkers te vinden door de tumorimmuunmicro-omgeving en het intratumorale microbioom bij primaire en gemetastaseerde ziekten te onderzoeken.
In ons project implementeren we momenteel verschillende technologieën zoals RNA-sequencing, whole exome sequencing, TCR sequencing circulerende celvrije DNA-analyse, immunofluorescentie en fluorescentie-instituut hybridisatie. Op dit moment is onze grootste uitdaging om fluorescentie-instituut hybridisatiekleuring te combineren met tyramide signaalversterking multiplex immunofluorescentie om de interactie tussen het microbioom en de immuuncellen te bestuderen. Onze methode is robuust, reproduceerbaar, gebruiksvriendelijk en kosteneffectief.
Het kan worden opgezet in elk laboratorium met een fluorescentielichtscanner en de methode kan worden gebruikt met elk commercieel verkrijgbaar IHC-antilichaam in tegenstelling tot commercieel verkrijgbare kits die meestal zijn geoptimaliseerd voor een beperkt paneel van antigenen.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor handmatige tyramide signaalversterking (TSA) multiplex immunofluorescentie (mIF) in combinatie met beeld- en ruimtelijke analyse. De methode is toepasbaar op in formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde (FFPE) coupes voor het kleuren van meerdere antigenen per objectglas.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Immunologie
- Pathologie
Achtergrond
- Onderzoek naar colorectale kanker bij de mens en de progressie ervan.
- Focus op de immuunmicro-omgeving van de tumor en het intratumorale microbioom.
- Gebruik van diverse technologieën, waaronder RNA-sequencing en immunofluorescentie.
- Uitdagingen bij het combineren van verschillende kleuringsmethoden voor een uitgebreide analyse.
Doel van de studie
- Om nieuwe predictieve en prognostische biomarkers te vinden.
- Om de interactie tussen het microbioom en immuuncellen te bestuderen.
- Om een robuuste en reproduceerbare kleuringsmethode te ontwikkelen.
Gebruikte methoden
- Handmatige tyramide-signaalversterking multiplex immunofluorescentie.
- Beeldanalyse met behulp van high-plex fluorescentie-algoritmen.
- Fluorescentie in situ hybridisatie in combinatie met immunofluorescentie.
- Gedetailleerd kleuringsprotocol voor FFPE-weefselcoupes.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle kleuring van meerdere antigenen op één enkel objectglas.
- Optimalisatie van de antilichaamspecificiteit en de signaal-ruisverhouding.
- Effectieve beeldanalyse die leidt tot kwantificeerbare gegevens.
- Demonstratie van de toepasbaarheid van de methode in verschillende laboratoria.
Conclusies
- De TSA mIF-methode is veelzijdig en kosteneffectief.
- Deze kan worden aangepast voor diverse antilichamen en antigenen.
- Deze aanpak verbetert het begrip van de tumobiologie.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Multiplex immunofluorescentie (mIF) met ruimtelijke beeldanalyse maakt hoogwaardige, kwantitatieve mapping van de tumormicro-omgeving (TME) mogelijk, wat bijdraagt aan de ontdekking van biomarkers en het mechanistisch reduceren van risico's in oncologische pipelines. Deze workflow biedt bruikbare inzichten in interacties tussen immuun- en stromale cellen, wat predictieve biomarkerstrategieën en translationeel onderzoek ondersteunt. De reproduceerbaarheid en compatibiliteit met diverse antilichamen maken dit tot een schaalbare mogelijkheid voor oncologische R&D op bedrijfsniveau.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt ruimtelijk opgeloste analyse van interacties tussen immuun- en tumorcellen mogelijk voor targetvalidatie.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door het kwantificeren van celtype-dichtheden en proximiteiten binnen tumorcompartimenten.
- Faciliteert de identificatie van nieuwe predictieve en prognostische biomarkers voor portefeuill triage.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde weefselsystemen voor op downstream multiplexe biomarker-screening.
- Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare en kwantitatieve ruimtelijke gegevens voor assay-ontwikkeling.
- Maakt een robuuste evaluatie van antilichaamspecificiteit en optimalisatie van de signaal-ruisverhouding mogelijk voor screening-gereedheid.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt ruimtelijke biomarkeranalyse af met ziekterelevante modellen voor translationele continuïteit.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door TME-kenmerken te koppelen aan hypothesen over therapeutische respons.
- Levert kwantitatieve resultaten voor vergelijkingen tussen verschillende studies en cohorten in preklinisch onderzoek.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze workflow voor mIF en ruimtelijke analyse slaat een brug tussen vroege ontdekking, biomarker-validatie en translationeel onderzoek binnen oncologieportfolio's.
- Ontdekkingsbiologie: Kwantificeert de distributie van immuun- en stromale cellen om TME-gestuurde mechanismen te verduidelijken.
- Screening: Standaardiseert gemultiplexte weefselassays voor reproduceerbare, kwantitatieve resultaten.
- Analytica: Exporteert ruimtelijke gegevens en dichtheidsgegevens voor statistische vergelijking van tumorcompartimenten en celinteracties.
- Translationeel onderzoek: Koppelt ruimtelijke biomarkerpatronen aan therapeutische respons, wat de continuïteit van preklinisch naar klinisch onderzoek ondersteunt.
- Bedrijfbrede herbruikbaarheid: Aanpasbaar aan elk antilichaampanel en tumortype, wat toepassing in een breed portfolio mogelijk maakt.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de selectie van biomarkers en targets door ruimtelijke celinteracties op te lossen.
- Operationele waarde: Levert reproduceerbare, schaalbare en kosteneffectieve gemultiplexte weefselanalyse.
- Strategische waarde: Onderbouwt go/no-go-beslissingen en vermindert biologische risico's in een laat stadium door middel van een robuuste karakterisering van de TME.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van oncologische assets mogelijk op basis van bewijs uit ruimtelijke biomarkers.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in immunofluorescentie, beeldanalyse en statistische gegevensverwerking.
- Toegang tot een fluorescente slide-scanner en compatibele beeldanalyse-software is noodzakelijk.
- Vereist cross-team standaardisatie van antilichaamvalidatie en kleuringsprotocollen.
- Aanpasbaar voor verschillende tumortypes en antilichaampanels met passende optimalisatie.
- Afhankelijk van strikte antilichaamspecificiteit en optimalisatie van de signaal-ruisverhouding voor betrouwbare resultaten.
