Eenvoudige oprichting van een gevasculariseerde osteogene beenmergniche met behulp van pre-cast poly (ethyleenglycol) (PEG) hydrogels in een beeldvormende microplaat
19 mei 2023
Een in vitro model van de vasculaire niche van het beenmerg wordt vastgesteld door mesenchymale en endotheelcellen te zaaien op pre-cast 3D PEG-hydrogels. De endotheelnetwerken, ECM-componenten en ALP-activiteit van de niches variëren afhankelijk van de gebruikte groeifactor. Het platform kan worden gebruikt voor geavanceerde kankermodellen.
De meeste in vitro vascularisatiestudies gebruiken natuurlijk afgeleide matrices. Hoewel ze doorgaans zeer geleidend zijn voor biologische processen, bemoeilijkt hun inherente biologische activiteit de studie van invloeden van afzonderlijke parameters. Hier kunnen we selectief onze spelers van belang toevoegen en beoordelen hoe het systeem verandert.
Het sequentieel zaaien van cellen op onze blanke leisteen synthetische hydrogels maakt de vorming van zeer gedefinieerde niches mogelijk. Hier koloniseren hBMMS'en de hydrogels en zetten hun inherente extracellulaire matrix af. Dit levert het substraat voor de vervolgens gezaaide endotheelcellen.
Deze functie wordt niet vaak aangetroffen in andere 3D in vitro modellen. De mogelijkheid om verschillende celtypen sequentieel toe te voegen, maakt het mogelijk om in vitro modellen met hoge doorvoer te maken met een grote complexiteit. Deze modellen kunnen worden aangepast om meer specifieke osteogene gevasculariseerde niches te genereren en om de functies van cellulaire en moleculaire spelers te onderzoeken.
Overzicht
Deze studie vestigt een in vitro-model van de vasculaire niche van het beenmerg met behulp van 3D PEG-hydrogels. Het model maakt het sequentieel uitzaaien van mesenchymale en endotheliale cellen mogelijk, waardoor de interacties tussen cellen en de effecten van groeifactoren op de ontwikkeling van de niche kunnen worden onderzocht.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Weefseltechnologie
Achtergrond
- Traditionele in vitro-modellen maken vaak gebruik van natuurlijk afgeleide matrices, wat de studie van specifieke parameters bemoeilijkt.
- De synthetische hydrogels bieden een gecontroleerde omgeving voor het uitzaaien van cellen.
- Sequentiële toevoeging van cellen maakt de creatie van complexe, high-throughput-compatibele modellen mogelijk.
- Deze modellen kunnen worden aangepast om osteogene gevasculariseerde niches te bestuderen.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een synthetisch in vitro-model voor het bestuderen van vasculaire niches in het beenmerg.
- Het beoordelen van de impact van verschillende groeifactoren op de vorming van endotheliale netwerken.
- Het mogelijk maken van high-throughput experimenten met gedefinieerde cellulaire interacties.
Gebruikte methoden
- Uitzaaien van hBM-MSCs en GFP-HUVECs op PEG-hydrogels.
- Monitoren van de ontwikkeling van de celcultuur met behulp van brightfield- en fluorescentiemicroscopie.
- Kwantificering van endotheliale netwerkparameters met behulp van ImageJ-analyse.
- Beoordeling van de effecten van groeifactoren op het celgedrag en de netwerkvorming.
Belangrijkste resultaten
- Endotheliale netwerken vormden zich uitgebreider in aanwezigheid van FGF-2 vergeleken met BMP-2.
- Er werd een hogere interconnectiviteit waargenomen met groeifactoren dan zonder deze.
- Kwantitatieve analyse toonde significante verschillen aan in netwerklengte en knooppunten op basis van de aanwezigheid van groeifactoren.
- Het model demonstreerde succesvol het vermogen om gedefinieerde vasculaire niches te creëren.
Conclusies
- Het ontwikkelde model is een waardevolle tool voor het bestuderen van vasculaire niches in het beenmerg.
- Sequentiële celzaaiing vergroot de complexiteit van in vitro studies.
- Groeifactoren hebben een significante invloed op de ontwikkeling van het endotheelnetwerk.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Het creëren van een gevasculariseerde osteogene beenmergniche in een high-throughput, beeldvormingscompatibel formaat vult een kritiek hiaat in de preklinische geneesmiddelenontwikkeling. Dit 3D PEG-hydrogelplatform maakt gecontroleerd onderzoek mogelijk van cellulaire en moleculaire interacties die relevant zijn voor de biologie van bot en beenmerg, wat bijdraagt aan de voorspellende betrouwbaarheid in vroege fasen van pijplijnen voor oncologie en botziekten. De reproduceerbaarheid en kwantificeerbaarheid hiervan faciliteren een robuuste validatie van targets en mechanische risicoreductie voor de verdere ontwikkeling van het portfolio.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt nauwkeurige manipulatie van cellulaire en matrixcomponenten mogelijk voor hypothesegedreven targetvalidatie.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door het isoleren van de effecten van groeifactoren en celtypen op de vorming van de vasculaire niche.
- Faciliteert de functionele beoordeling van osteogene en angiogene routes in een ziekterelevante 3D-context.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Biedt een gestandaardiseerd, reproduceerbaar 3D co-cultuursysteem dat compatibel is met high-content imaging en kwantificering.
- Maakt een robuuste, kwantitatieve meting van vasculaire netwerkparameters en osteogene differentiatiemarkers mogelijk.
- Maakt schaalbare, automatisering-klare workflows mogelijk voor compound screening en fenotypische assays.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Modelleert de menselijke beenmergmicro-omgeving voor translationele studies naar interacties tussen kankercellen en metastase.
- Sluit aan bij biomarker-gestuurde benaderingen door ALP-activiteit en metrieken van het vasculaire netwerk te kwantificeren.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door 2D in vitro en in vivo modellen te overbruggen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit platform integreert in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek door hypothesetoetsing, kwantitatieve screening en translationele modellering mogelijk te maken binnen één enkel, herbruikbaar systeem.
- Discovery Biology: Maakt isolatie en testen van specifieke groeifactoren of celtypen mogelijk om de rollen van signaalpaden te verduidelijken.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor vasculaire en osteogene eindpunten die geschikt zijn voor high-throughput analyse.
- Analytics: Ondersteunt geautomatiseerde beeldanalyse en normalisatie voor robuuste vergelijkingen tussen verschillende condities.
- Translationeel onderzoek: Biedt een mens-relevant model voor het bestuderen van interacties in de kanker-beenmergniche.
- Bedrijfsvoering en hergebruik: Biedt een modulair, aanpasbaar platform voor diverse R&D-programma's gericht op bot, beenmerg of metastatische ziekten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert biologische ambiguïteit bij de validatie van targets en signaalpaden.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid voor multi-site en crossfunctionele teams.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen en de kapitaalefficiëntie door vroeg in de pijplijn robuuste, kwantificeerbare gegevens te verschaffen.
- Impact op de portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en bevordering van kandidaten met gevalideerde mechanistische onderbouwing mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in 3D-celkweek, imaging en kwantitatieve beeldanalyse.
- Vereist toegang tot fluorescentiemicroscopie, platenlezers en compatible analytische software (bijv. ImageJ).
- Vereist cross-team standaardisatie van celbronnen, matrixbereiding en kwantificeringsprotocollen.
- Aanpasbaar aan diverse celtypen en groeifactorcondities voor ziektespecifieke modellering.
- Beperkingen omvatten de noodzaak voor zorgvuldige normalisatie en validatie van kwantificeringsalgoritmen over verschillende experimentele runs.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:04
Establishing the 3D Stromal Monoculture
2:44
Establishing the 3D Stromal‐Endothelial Cell Co‐Culture
4:25
Quantifying the Endothelial Cell Network Formation after the 3D Stromal‐Endothelial Cell Co‐Culture
6:53
Assessing the Osteogenic Differentiation of 3D Stromal‐Endothelial Cells by Monitoring the Alkaline Phosphatase Activity
