Geoptimaliseerde kernisolatie van verse en diepgevroren solide tumormonsters voor multioomsequencing
13 oktober 2023
Het protocol biedt een betrouwbare en geoptimaliseerde benadering voor de isolatie van kernen uit solide tumormonsters voor multioomsequencing met behulp van het 10x Genomics-platform, inclusief aanbevelingen voor weefseldissociatieomstandigheden, cryopreservatie van eencellige suspensies en beoordeling van geïsoleerde kernen.
Naarmate onze kennis van tumorbiologie groeit en onze interesse om de fijne kneepjes te begrijpen van hoe cellen in de tumor interageren en de resultaten van de patiënt beïnvloeden, is ook het belang van het analyseren van heterogene cellen in de micro-omgeving van de tumor toegenomen. Multioomsequencing, die het mogelijk maakt om op een gepaarde celmanier RNA van één cel en aanvalssequencing van dezelfde cel te verwerven, biedt een belangrijke vooruitgang in de richting van dit doel. De kwaliteit van de gegevens die uit deze experimenten worden verkregen, is echter sterk afhankelijk van de kwaliteit van de experimentele omstandigheden en het ingevoerde biologische materiaal.
Dit protocol biedt een betrouwbare en geoptimaliseerde benadering voor de isolatie van kernen uit solide tumormonsters voor multioomsequencing met behulp van het 10x Genomics-platform. Dit protocol is betrouwbaar bij gebruik van verse of diepgevroren eencellige suspensies. We geven aanbevelingen voor weefseldissociatiecondities, cryopreservatie van eencellige suspensies en beoordeling van geïsoleerde kernen.
In dit protocol gebruikten we menselijke ductaal adenocarcinoommonsters van de pancreas, die in ons laboratorium een primaire weefselfocus zijn. Alvleesklierkanker vertegenwoordigt een zeer desmoplastisch tumortype, dat zowel relatief kleverig weefsel als cellen voorspelt. Bovendien, aangezien pancreastumorspecimens die beschikbaar zijn voor onderzoek ook relatief klein zijn, worden inspanningen geleverd om de hoeveelheid gevangen cellen te maximaliseren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een betrouwbare en geoptimaliseerde methode voor het isoleren van kernen uit vaste tumorstalen voor multi-om sequencing met behulp van het 10x Genomics platform. Het bevat aanbevelingen voor weefseldissociatiecondities en cryopreservering van single-cell suspensies.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Oncologie
- Genomica
Achtergrond
- Het begrijpen van de tumorbiologie is essentieel voor het verbeteren van de patiëntuitkomsten.
- Het analyseren van heterogene cellen in de tumoromgeving is steeds belangrijker.
- Multi-om sequencing maakt de gepaarde acquisitie van single-cell RNA- en ATAC-sequencing mogelijk.
- De datakwaliteit is sterk afhankelijk van de experimentele condities en het biologische materiaal.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar protocol te bieden voor het isoleren van kernen uit solide tumoren.
- Om de kwaliteit van multi-om sequencing-gegevens te verbeteren.
- Om de analyse van tumor-micro-omgevingen te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Isolatie van kernen uit solide tumorbiopten.
- Gebruik van verse of bevroren enkelcel-suspensies.
- Aanbevelingen voor weefseldissociatiecondities.
- Cryopreservatietechnieken voor enkelcel-suspensies.
Belangrijkste resultaten
- Een geoptimaliseerde aanpak voor nuclei-isolatie is vastgesteld.
- Betrouwbare resultaten zijn behaald bij zowel verse als bevroren monsters.
- Verbeterde datakwaliteit voor multi-om sequencing.
- Richtlijnen voor weefselverwerking en cryopreservatie zijn verstrekt.
Conclusies
- Het protocol verhoogt de betrouwbaarheid van de isolatie van kernen uit tumoren.
- Het ondersteunt de verdere ontwikkeling van multi-om sequencingtechnieken.
- Toekomstige studies kunnen profiteren van verbeterde experimentele omstandigheden.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Geoptimaliseerde isolatie van kernen uit solide tumorbiopten is cruciaal voor het genereren van hoogwaardige multiome-sequencingdata, wat direct van invloed is op de betrouwbaarheid van analyses van tumorheterogeniteit in de translationele oncologie. Dit protocol pakt de uitdaging aan van het extraheren van intacte kernen uit zowel verse als bevroren desmoplastische tumorweefsels, ter ondersteuning van robuuste single-cell multiomic profiling. Betrouwbare preparatie van kernen in deze fase verhoogt het voorspellende vertrouwen in downstream discovery- en biomarkerontwikkelingspipelines.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt getrouwe analyse van de heterogeniteit van tumorcellen op single-cell niveau mogelijk.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door diverse celpopulaties tijdens de isolatie te behouden.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie door een nauwkeurige weergave van de tumoromgeving.
Screening & assayontwikkeling
- Biedt gestandaardiseerde kernpreparaten voor reproduceerbare multiome sequencing-assays.
- Garandeert kwantitatieve en kwalitatieve consistentie van het inputmateriaal voor downstream workflows.
- Verbetert de assay-gereedheid door zowel verse als cryogepreserveerde tumorstalen te accommoderen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij de ontdekking van translationele biomarkers door gekoppelde profilering van RNA en chromatine-toegankelijkheid mogelijk te maken.
- Behoudt de ziekterelevantie door de complexiteit van micro-omgevingen van solide tumoren vast te leggen.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door de kwaliteit van de input te standaardiseren.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol voor nuclei-isolatie bevindt zich op het snijvlak van weefselverwerking en de generering van multiomische data, waarmee een brug wordt geslagen tussen vroege ontdekkingsfasen en translationele onderzoeksworkflows.
- Ontdekkingsbiologie: Maximaliseert de kracht van hypothesetoetsing door celdiversiteit en -integriteit te behouden.
- Screening: Levert reproduceerbare kernen van hoge kwaliteit voor schaalbare multiome sequencing-assays.
- Analytiek: Maakt robuuste kwantitatieve readouts mogelijk voor het vergelijken van tumorceltoestanden en chromatinelandschappen.
- Translationeel onderzoek: Faciliteert de afstemming van biomarkers door ondersteuning van gepaarde single-cell RNA- en ATAC-seq-analyses.
- Bedrijfsbrede hergebruik: Vestigt een gestandaardiseerd, aanpasbaar protocol voor diverse typen solide tumoren en monstercondities.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in studies naar tumorbiologie en targetvalidatie.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid bij zowel verse als bevroren tumorstalen.
- Strategische waarde: Vermindert het risico op gegevensverlies of de introductie van artefacten tijdens de fase van monstervoorbereiding.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde vooruitgang van ontdekkings- en translationele programma's in de oncologie.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in weefseldissociatie en het behandelen van kernen voor een optimale opbrengst en kwaliteit.
- Vereist toegang tot gespecialiseerde reagentia, celzeven en instrumenten voor kwantitatieve beoordeling.
- Maakt standaardisatie van digestie- en lysiscondities tussen teams noodzakelijk voor reproduceerbaarheid.
- Moet worden aangepast aan verschillende tumortypen en monstergroottes, met name voor desmoplastisch weefsel.
- Zorgvuldige monitoring van de nucleaire integriteit is essentieel om downstream sequencing-artefacten te voorkomen.
