Monitoring Actin Demontage met Time-lapse Microscopie
8 november 2006
Vandaag wil ik u laten zien hoe u een flowkamer construeert, een fusiekamer voor beeldvorming op een rechtopstaande microscoop. Hiervoor creëer ik twee ruimtes met behulp van folie. Ik neem hiervoor parafilm en snijd dit in kleine stroken.
Vervolgens ga ik, dit zal in feite de kanalen voor de wanden vormen, en ik droog ze met een schuine luchtstroom. Ik plaats het dekglas bovenop de paraffine, en hier is het resultaat. Daarna verhit ik het op een warmteblok om de paraffine te smelten en zo in feite een afdichting te creëren.
Dit is dus het dekglas hier, en bovenop het dekglas bevinden zich twee lagen phim, zoals u hier ziet. En daarop ligt vervolgens weer een dekglas van 22 bij 22 mm. Dit exemplaar hier, dat ik tegen de param heb gedrukt om de verzegeling te vormen.
Oké, de vloeistof stroomt hier in één richting naar binnen en ik kan deze hier in deze richting wegzuigen met een filterpapier. Ik zal u zo laten zien hoe u dat doet. Wat ik graag doe, is het in een bevochtigingskamer plaatsen, wat heel eenvoudig is.
Neem twee soorten verhoogde strips en plaats daar een filterpapier onder. Om het systeem afgesloten te houden, plaats ik het dekglas op de flowcel. De manier waarop u een oplossing in de cel introduceert, is door de pipetpunt bij de ingang van de cel te plaatsen en vervolgens te dispenseren.
Vervolgens incubeer ik de kamer gedurende 10 minuten met het deksel gesloten. Om de vloeistof aan de andere zijde af te zuigen, gebruik ik gewoonlijk filterpapier dat in dunne strips is gesneden, zoals hier te zien is. Ik neem een van deze dunne strips en breng gelijktijdig de oplossing aan bij de ingang, terwijl ik het filterpapier bij de uitgang plaats om de uitwisselingsoplossing op te zuigen.
U ziet nu de vloeistof door de oplossing stromen. Vervolgens wacht ik vijf minuten tot de afsluiting voltooid is. Nu ben ik klaar om het actine toe te voegen; ik moet het actine polymeriseren, wat ik binnen de flowkamer doe volgens dezelfde procedures als hiervoor.
Omdat de actine nu gepolymeriseerd is, spoel ik alle overtollige, niet-gepolymeriseerde actine weg met een groot volume buffer. Ik gebruik hier ongeveer 100 µL, wat overeenkomt met enkele volumes van de reactiekamer aan buffer. Zodra het filterpapier verzadigd raakt, moet ik de richting veranderen. Oké?
Ik ben nu klaar om hiermee beelden op te nemen. De perfusiekamer is voorzien van gebonden actine. Nu neem ik het objectglas, monteer ik het onder de microscoop en aangezien ik beelden opneem met een olie-objectief, breng ik immersie-olie aan op het bovenoppervlak van het dekglas, zodat de oplossing, het eiwit of wat er ook aan het actine is gebonden, behouden blijft.
Wat ik dus doe, is dat ik de oplossing aan de ene zijde kan vervangen terwijl ik de time-lapse imaging uitvoer. Op die manier.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
In dit artikel wordt de constructie van een flowkamer en een fusiekamer gedemonstreerd voor beeldvorming op een rechtopstaande microscoop. Het proces omvat het creëren van kanalen met parafilm en het afdichten ervan met hitte.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
Achtergrond
- Stroomkamers zijn essentieel voor diverse beeldvormingstechnieken.
- Het construeren van een fusiekamer maakt verbeterde beeldvormingsmogelijkheden mogelijk.
- Parafilm wordt in laboratoriumomgevingen veelvuldig gebruikt voor het maken van afdichtingen.
- Inzicht in het constructieproces is cruciaal voor onderzoekers in dit vakgebied.
Doel van de studie
- Om een stapsgewijze handleiding te bieden voor het construeren van een flowkamer.
- Om het gebruik van parafilm bij het creëren van beeldvormingskamers te illustreren.
- Om de toegankelijkheid van beeldvormingstechnieken voor onderzoekers te vergroten.
Gebruikte methoden
- Het snijden van parafilm in stroken om kanalen te vormen.
- Het drogen van de stroken met schuine luchtstroom.
- Het plaatsen van een dekglas bovenop de parafilm.
- Het verhitten van de assemblage op een heatblock om een verzegeling te creëren.
Belangrijkste resultaten
- Een functionele flowkamer is succesvol geconstrueerd.
- Het afdichtingsproces was effectief in het creëren van een stabiele omgeving voor beeldvorming.
- De gedemonstreerde methode is reproduceerbaar voor laboratoriumgebruik.
- Onderzoekers kunnen deze techniek gebruiken voor diverse beeldvormingsapplicaties.
Conclusies
- De constructie van stroom- en fusiekamers is eenvoudig.
- Deze methode kan geavanceerde beeldvormingsstudies faciliteren.
- Toegankelijkheid tot dergelijke technieken kan de onderzoeksresultaten verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Dit protocol maakt de reproduceerbare preparatie van gecontroleerde micro-omgevingen voor live-cell imaging mogelijk, ter ondersteuning van mechanistische studies naar cytoskeletdynamiek. Door de assemblage van de flowkamer te standaardiseren, wordt de variabiliteit in perfusie-gebaseerde assays verminderd, wat de consistentie van de gegevens tussen onderzoeksteams verbetert. De methode faciliteert de kwantitatieve analyse van de kinetiek van actine-disassemblage, een sleutelproces in celmotiliteit en signaaltransductie dat relevant is voor targetvalidatie in de oncologie en immunologie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt directe observatie van de dynamiek van actinedepolymerisatie mogelijk om regulatoren van cytoskeletale remodellering te onderzoeken.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerd platform voor het testen van de effecten van verbindingen op de actinomzetting in levende cellen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de ontwikkeling van fluorescentiegebaseerde read-outs voor actin-desassemblagesnelheden als functioneel assay-eindpunt.
- Operationele waarde: Maakt oplossingenuitwisseling tijdens time-lapse imaging mogelijk om dosis-responsvariabelen onder perfusie te beoordelen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Koppel actin-dynamiek aan cellulaire fenotypes die relevant zijn voor metastase, invasie en de vorming van de immuunsynaps.
- Operationele waarde: Maakt preklinische beoordeling van pathway-remmers mogelijk met behulp van kwantificeerbare imaging-biomarkers.
Pipeline- & workflowintegratie
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van screening op target-engagement tot functionele validatie in ziekte-relevante cellulaire systemen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van cytoskeletregulatoren via real-time visualisatie van actineflux.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare metingen van actinedismanteling onder gecontroleerde perfusiecondities.
- Analytics: Genereert tijdopgeloste fluorescentie-intensiteitsgegevens die kinetische modellering van actine-omzetting mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt moleculaire mechanismen aan cellulaire fenotypes in preklinische modellen van celmigratie.
- Bedrijfsvoering en hergebruik: Vestigt een herbruikbaar perfusieplatform dat aanpasbaar is aan meerdere cytoskeletdoelen en celtypen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Mechanistische risicovermindering van targets betrokken bij actine-regulatie via directe functionele read-outs.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde voorbereiding van de kamer verbetert de reproduceerbaarheid van de assay tussen verschillende locaties en operators.
- Strategische waarde: Maakt eerdere go/no-go-beslissingen mogelijk door target-modulatie te koppelen aan functionele resultaten van het cytoskelet.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen op basis van effecten op celmotiliteit en invasie-fenotypes.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in live-cell imaging en microfluïdische stroombeheersing.
- Is afhankelijk van toegang tot rechtopstaande microscopen met omgevingscontrole en perfusiecapaciteiten.
- Vereist standaardisatie van de dikte van de parafilm en de afdichtingsparameters voor consistentie tussen de kamers.
- Aanpassing aan verschillende celtypen kan optimalisatie van de oppervlaktecoating en actinepolymerisatiecondities vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten potentiële effecten van schuifspanning op cellen tijdens langdurige perfusie, zoals vermeld in het protocol.
