R, Seurat en CellChat gebruiken om een single-cell transcriptomics-dataset van wondgenezing van de huid van muizen te analyseren

In ons lab gebruiken we opkomende tools zoals single-cell en ruimtelijke transcriptomics met systeembiologie en bio-informaticabenaderingen om de ruimtelijke temporele cellulaire dynamiek van differentiële genezingsresultaten te onderzoeken. In de afgelopen jaren hebben we een snelle acceptatie gezien van eencellige transcriptomics voor de studie van wondgenezing bij mensen en in modelorganismen, zoals muizen. De volledige analyse van single-cell datasets is onbetaalbaar voor benchwetenschappers met weinig tot geen ervaring met bio-informatica. Dit betekent dat single-cell datasets maar al te vaak onderbenut worden door wetenschappers op het gebied van wondgenezing. Dit is het eerste uitgebreide protocol dat uitgaat van geen eerdere ervaring met bio-informatica, waarbij een gebruiker wordt meegenomen van het downloaden van de dataset tot de output van relevante analyses in de context van wondgenezingsonderzoek. Ons protocol moet dienen als een sjabloon voor onderzoekers naar wondgenezing om hun eigen eencellige datasets vollediger te analyseren en nieuwe inzichten te kunnen extraheren uit openbaar beschikbare datasets.

[Shalyn] Navigeer om te beginnen naar de gegevenssetbestanden van de omnibusrepository voor genexpressie met behulp van het toetredingsnummer GSE204777. Klik op de eerste dataset met de titel GSM6190913. Scroll naar de onderkant van de GSM6190913 pagina en download de drie vermelde bestanden met behulp van de FTP- of HTML-koppelingen. Verplaats de gedownloade bestanden met behulp van de bestandsverkenner van de computer naar een map met de naam b1 en zorg ervoor dat deze zich in de werkmap bevindt. Haal de informatie over het mappad op voor de sequentiebestanden met één cel die zijn gedownload. Laad nu de sequencingbestanden met één cel in de werkomgeving. Scheid vervolgens de genexpressie en multiplexing HTO-gegevens van de werkende dataset. Maak een Seurat-object met behulp van de genexpressiegegevens en filter genen die zijn gedetecteerd in minder dan vijf cellen en cellen met minder dan 200 genen. Voor datasets zonder HTO-gegevens maakt u het Seurat-object met dezelfde filterparameters en schakelt u over naar de genexpressietest. Bereken het mitochondriale genpercentage in elke cel en wijs deze waarde toe als een metagegevensvariabele. Visualiseer de verdeling van het aantal genen, het totale RNA en het percentage mitochondriale genen over alle cellen. Verwijder cellen met een mitochondriale inhoud van meer dan 25% met behulp van een drempelwaarde en visualiseer de bijgewerkte verdelingen na het uitfilteren van deze cellen van lage kwaliteit. Detecteer waarschijnlijke doubletten met behulp van de SC-doubletzoekermethode. Voer de SC-doubletfinder-pijplijn uit met behulp van de opdrachten en wijs de resulterende doubletscores toe als een nieuwe metagegevensvariabele. Visualiseer nu de verdeling van doubletscores over alle cellen. Verwijder alle cellen met een doubletscore boven 0,25 en sla het opgeschoonde Seurat object op als een RDS-bestand in de werkmap. Voer gegevensnormalisatie, schaalvergroting en analyse van hoofdcomponenten uit. Visualiseer de variantiebijdrage over de eerste 50 hoofdcomponenten. Cluster de cellen met behulp van de eerste 13 hoofdcomponenten en een clusterresolutie van 0,1. Voer een uniforme spruitstukbenadering en -projectie uit, of UMAP-reductie in buuranalyse, met behulp van de eerste 13 hoofdcomponenten en stel het seed-nummer in op 123. Visualiseer nu celclustering op een UMAP-plot, gevolgd door annotaties van wondtijd en -ruimte op een UMAP-plot. Genereer vervolgens een tabel die celclusters associeert met annotaties voor wondtijd en -ruimte. Bepaal de belangrijkste identiteiten van het celtype na het berekenen van differentieel tot expressie gebrachte genen tussen alle clusters en wijs de resulterende DEG-lijsten toe aan een variabele voordat u ze opslaat als een gescheiden tekstbestand in de werkmap. Open nu het bestand met clustermarkeringen voor gegevenssets in een spreadsheettoepassing. Gebruik de wizard Tekst importeren om de komma in te stellen als scheidingsteken en maak kolommen met gennamen op als tekst om te voorkomen dat gennamen automatisch worden omgezet in datums. Rangschik in een spreadsheet de gemiddelde log twee FC-kolom van groot naar klein om de rijen te ordenen door de log tweevoudige wijzigingswaarden te verlagen, gevolgd door de clusterkolom van klein naar groot. Als u de rijen wilt ordenen door de Seurat clusternummers te verhogen, filtert u de gemiddelde log twee FC-kolom om alleen waarden groter dan of gelijk aan 2,5 op te nemen en filtert u vervolgens de PCT 1-kolom om waarden groter dan of gelijk aan 0,4 op te nemen. Filter vervolgens de PCT 2-kolom om waarden op te nemen die kleiner zijn dan of gelijk zijn aan 0,2. Filter ten slotte de kolom Aangepaste P-waarde om waarden op te nemen die kleiner zijn dan of gelijk zijn aan 0,01. Open nu de webgebaseerde verrijkingsanalysetool Enrichr. Kopieer voor elk cluster de lijst met genen die differentieel tot expressie worden gebracht naar een afzonderlijk Enrichr-venster en klik op analyseren. Klik vervolgens op het tabblad Celtypen boven de analyse-uitvoer en concentreer u op de top vijf verrijkingen binnen de drie gecureerde celmarkerdatabases. Wijs op basis van de belangrijkste verrijkingen uit de Enrichr-analyse waarschijnlijke identiteiten toe aan de acht clusters. Combineer clusters twee en zes in een enkele annotatie met het label fibroblasten en wijs deze annotaties toe als een nieuwe metadatavariabele met de naam celtypen. Visualiseer vervolgens de geannoteerde celtypen op een UMAP-plot en toon de lokalisatie van de vetgedrukte markergenen van de bovenste cluster op een reeks UMAP-plots. Visualiseer de genen van de bovenste clustermarker die differentieel tot expressie komen op een puntdiagram gegroepeerd op oorspronkelijke clusternummers, en vervolgens de bovenste markergenen opnieuw in een puntdiagram, dit keer gegroepeerd op geannoteerde celtypen. Om u voor te bereiden op tijdreeksanalyse, verwijdert u ruimtelijke annotatie en vereenvoudigt u de gegevensset. Wijs de metagegevens van de wondtijd en -ruimte opnieuw toe aan een nieuwe variabele met de naam DPW voor Days Post Wounding. Visualiseer de nieuwe DPW-tijdcursusgroeperingen op een UMAP-plot en genereer tabellen met het aantal cellen van elk type binnen elke DPW-groep. Converteer vervolgens het aantal cellen naar verhoudingen om relatieve veranderingen in de samenstelling van het celtype tijdens genezing te beoordelen en visualiseer het aandeel van elke DPW-categorie binnen elk celtype. Visualiseer ten slotte het aandeel van elk celtype binnen elke DPW-groep en sla het uiteindelijke Seurat-object met alle annotaties en filters op als een RDS-bestand in de werkmap. Alle cellen in de dataset waren duidelijk geclusterd in de belangrijkste kleurgecodeerde celtypen op de UMAP-plot, wat een succesvolle annotatie bevestigt op basis van verrijkte celtypehandtekeningen. Hoge expressie van topclustermarkergenen werd gelokaliseerd binnen hun respectievelijke celtypeclusters op de UMAP-plots. Dot plot-visualisatie bevestigde dat de hoogste expressieniveaus van clustermarkergenen beperkt waren tot hun geannoteerde hoofdceltypen. De gestapelde staafplot onthulde dat neutrofielen en macrofagen dominant waren op de eerste dag na de verwonding, terwijl fibroblasten, epitheelcellen en endotheelcellen op latere tijdstippen vaker voorkwamen, wat de bekende cellulaire cascade van wondgenezing weerspiegelt.