Kwantificering van het verzorgingsgedrag van Drosophila melanogaster voor evaluatie van overmatige verzorgingsfenotypes

Ons onderzoek evalueert het vlooigedrag van Drosophila melanogaster na RNAi-gemedieerde Atg8a-knockdown om GABARAP-tekorten te modelleren die zijn waargenomen bij patiënten met het Tourette-syndroom. We streven ernaar de rol van aAtg8a in gedragsontwikkeling te begrijpen en inzicht te geven in de regulerende functies van zijn menselijke tegenhanger in neuro-gedragsprocessen. Huidige experimentele uitdagingen met de handmatige annotatiemethode zijn onder meer het complexe analytische proces, zoals het annoteren en beoordelen van beeldmateriaal, en de subjectiviteit die betrokken is bij handmatige annotatie.

Geautomatiseerde methoden worden ook geconfronteerd met uitdagingen, waaronder de vereiste van substantiële computerwetenschappelijke expertise om effectief te implementeren en uit te voeren. We hebben ontdekt dat het gen Atg8a een rol speelt bij de ontwikkeling van gedrag bij fruitvliegen dat verder gaat dan wat eerder is vastgesteld. Meer specifiek ontdekten we dat het zowel vlooien als leren reguleert, wat suggereert dat Atg8a-orthologen vergelijkbare rollen kunnen spelen in andere organismen.

Deze techniek maakt het mogelijk om de frequentie en distributie van de vlooiende in Drosophila direct te kwantificeren. Het is vooral nuttig in laboratoria die geen geautomatiseerde methoden kunnen gebruiken en maakt een gedetailleerdere analyse mogelijk dan indirecte, op kleurstoffen gebaseerde methoden. Over het algemeen bevordert ons onderzoek het gebruik van Drosophila als modelorganisme voor het bestuderen van neurologische ontwikkelingsstoornissen die obsessief-compulsief gedrag vertonen, zoals het syndroom van Gilles de la Tourette.

Het draagt ook bij aan het toenemende bewijs dat autofagie-gerelateerde eiwitten een rol spelen bij gedragsontwikkeling. Plaats om te beginnen vier schaaltjes met drie putjes naast elkaar op een wit oppervlak en bedek elke schaal met een glasplaatje. Plaats een camera boven de vaat.

Zorg ervoor dat er geen schittering op de dia's is die de zichtbaarheid van vliegen in de schotel zou kunnen beperken en pas de positie van de plaat aan of dim de lichten indien nodig om verblinding te voorkomen. Markeer nu de positie van de gerechten en de camera op de bank waar de opname plaatsvindt. Leg vliegen van vier tot negen dagen oud op een ijsblok bedekt met parafilm en een papieren handdoek om ze licht te verdoven.

Eenmaal verdoofd, verplaats je de vliegen zo snel mogelijk met een penseel naar observatiekamers. Plaats een vlieg in elk putje van de schotel met drie putjes en zorg voor minimale verstoring om te voorkomen dat door stress veroorzaakte gedragsveranderingen worden uitgelokt. Nadat u de vliegen 30 minuten na de anesthesie hebt geacclimatiseerd, neemt u de vliegen op met een camera, opent u vervolgens de terminal en typt u cd PiSpy.

Typ python3 PiSpy. PY en voer de gewenste opnamelengte en framesnelheid in. Selecteer de gewenste resolutie en klik op Quick Capture.

Gebruik nu de Preview Camera-functie in Pi Spy om ervoor te zorgen dat de vliegen scherp en voldoende zichtbaar zijn. Neem de vliegen 10 minuten op met een aanbevolen framesnelheid van 24 frames per seconde en sla het bestand op. Om de video te analyseren, importeert u het bestand in de ELAN 6.8-software voor gedetailleerde annotatie en diepgaande analyse van het verzorgingsgedrag.

Selecteer Niveau, Voeg een nieuw niveau toe, typ locatie in de schotel in de naam van het niveau en voeg toe om elke rij toe te wijzen om de beelden van personen handmatig te annoteren. Als u gedrag wilt annoteren, dubbelklikt u op het niveau dat u wilt annoteren, klikt u met de rechtermuisknop en sleept u de cursor langs het geselecteerde niveau gedurende een periode waarin een enkele verzorgingswedstrijd wordt vertoond. Klik met de linkermuisknop om een nieuwe aantekening te selecteren en dubbelklik op de zojuist gemarkeerde tijdsperiode om de afkorting te typen voor het gedrag dat op dat tijdstip is waargenomen.

Zodra de video volledig is geannoteerd, verkrijgt u een uitsplitsing van elk gedrag door op Weergave te klikken, gevolgd door Annotatiestatistieken. Identificeer voorste vlooiing als vlooiing die wordt uitgevoerd in het voorste deel van het lichaam van de vlieg. Identificeer posterieure verzorging als verzorging die wordt uitgevoerd aan het voorste-achterste uiteinde van het vliegenlichaam.

Verzorgingsaanvallen namen significant toe in Atg8a RNAi-mutanten in vergelijking met controlegroepen. De tijd die werd besteed aan vachtverzorging was ook significant verhoogd in Atg8a RNAi-mutanten in vergelijking met controles. Er werden geen significante verschillen waargenomen in de verdeling van anterieure versus posterieure vlooiingsgedrag.