Experimentele screeningprotocollen, immunocytochemie en op microscopie gebaseerde beeldvormingstechnieken voor penium margaritaceum

Ons onderzoek richt zich op de rol van de celwand bij het behouden van de celvorm en het reageren op externe stress. We gebruiken een reeks lichtmicroscopie en confocale laserscanningmicroscopietechnieken voor het in beeld brengen van de celwandstructuur in levende cellen en elektronenmicroscopie voor beeldvorming van celwanden met hoge resolutie.

Het huidige gebrek aan getransformeerde cellijnen voor streptofytenalgen die specifieke subcellulaire eiwitten tot expressie brengen om de dynamiek van de celwand te benadrukken, ontbreekt. Dit vereist dan het gebruik van antilichamen en andere fluorescerende sondes voor onderzoek. De celwand van Penium reageert op verschillende vormen van abiotische en biotische stress, en dit leidt tot fenotypische plasticiteit. We hebben ontdekt dat celwandpectines een belangrijk onderdeel zijn van dit proces. Het eencellige fenotype en het vermogen om live cell labeling uit te voeren met Penium biedt plantenbiologen de mogelijkheid om zich te verdiepen in de structuur en ontwikkeling van de celwand.

[Docent] Verwijder om te beginnen vijf milliliter actief groeiende vloeibare celculturen van Penium margaritaceum. Breng over in een plastic centrifugebuis van 15 milliliter en centrifugeer vervolgens. Na het uitgieten van het supernatant, suspendeer de pellet in vijf milliliter verse WHM. Zet de dop van de buis stevig vast en schud de buis krachtig gedurende 10 seconden om de pellet opnieuw te suspenderen en verwijder eventuele extracellulaire polymere substantie van het celwandoppervlak. Na de laatste wasbeurt, suspendeer de pellet opnieuw in één milliliter verse WHM en breng vervolgens 200 microliter aliquots van de celsuspensie over in microcentrifugebuisjes van 1.5 milliliter. Centrifugeer de dopbuisjes in de microcentrifuge gedurende één minuut bij 1000 G, zuig vervolgens het bovenstaande op en suspendeer de pellet opnieuw in 400 microliter vers WHM. Voeg vervolgens 20 microliter verdund monoklonaal antilichaam toe aan de celsuspensie en draaikolk. Wikkel de buis vervolgens in aluminiumfolie en incubeer deze gedurende 90 minuten op een laboratoriumrotator. Centrifugeer de suspensie, zuig de supernatant op en suspendeer de pellet opnieuw in 500 microliter verse WHM voordat u gedurende 10 seconden vortext. Na de laatste centrifugatie suspendeert u de pellet opnieuw in 400 microliter WHM en voegt u acht microliter geitenanti-rat TRITC of FITC toe. Resuspendeer ten slotte de korrel in 100 microliter groeimedium. Sluit de buis af en wikkel deze in aluminiumfolie tot hij klaar is voor beeldvorming. Verdun de cellen die zijn gelabeld met JIM5-antilichaam tienvoudig in WHM. Voeg een druppel van 50 microliter van de verdunde celsuspensie toe aan een dekglaasje. Incubeer de cellen gedurende twee minuten in het donker om celhechting mogelijk te maken en pipetteer vervolgens voorzichtig een milliliter WHM druppelsgewijs om eventuele niet-vastzittende cellen weg te spoelen. Voeg 30 microliter WHM toe bovenop de aangehechte cellen. Bedek de druppel met 30 microliter warme 4% agarose in WHM en laat het stollen. Voeg voor monsters in een petrischaaltje voldoende WHM toe om de in agarose ingebedde cellen volledig te bedekken. Voor cellen op een dekglaasje, keert u het dekglaasje om en plaatst u het voorzichtig over een depressieglaasje gevuld met WHM. Monteer de voorbereide cellen op een fluorescerende microscoop. Stel een externe lamp in of gebruik de ingebouwde verlichting van de microscoop om de celgroei en beweging te ondersteunen. Maak elke 10 tot 30 minuten foto's met behulp van de TRITC-filterset om de uitzetting van de celwand te volgen. Bereid een tube voor met vijf milliliter gewassen celculturen van 10 tot 14 dagen oud. Voeg vervolgens ongeveer 100 microliter fluorescerende kralen van 0,75 micrometer toe aan een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Pipetteer een milliliter WHM in de tube en schud krachtig om de kralen weer in suspentie te brengen. Centrifugeer de buis gedurende drie minuten op 10.000 G. Resuspendeer de uiteindelijke pellet in 500 microliter WHM. Piket vervolgens een milliliter WHM-medium op elk putje van een plaat met 12 putjes. Voeg remmers of groeiregulatoren toe om de gewenste concentratie te bereiken en draai de plaat voorzichtig rond. Voeg 10 microliter van de kralenoplossing toe en draai voorzichtig opnieuw om te mengen, voeg dan 10 microliter gewassen cellen toe aan elk goed voordat je gaat mengen. Incubeer de plaat gedurende 24 uur in het licht. Zonder de plaat te verstoren, plaatst u deze op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een FITC-filter. Pipetteer een milliliter van een celsuspensie uit in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Centrifugeer de buis gedurende één minuut bij 4.000 G. Nadat u het bovenstaande hebt weggegooid, dompelt u de buis met de pellet onder in vloeibare stikstof of vriest u deze in bij min 80 graden Celsius. Resuspendeer de ontdooide pellet in 20 microliter WHM. Plaats een druppel van de dichte celsuspensie op een dekglaasje van 45 bij 50 millimeter. Leg een tweede dekglaasje op de druppel om een sandwich te maken. Druk 30 seconden continu op de sandwich om de cellen te scheuren. Haal de dekglaasjes voorzichtig uit elkaar. Voeg WHM toe over de dekglaasjes om de gescheurde cellen in een centrifugebuis van 15 milliliter te wassen en te centrifugeren. Onderzoek de witte of lichtgroene korrel nadat u de supernatant hebt weggegooid. Resuspendeer de pellet met de celwanden in gedeïoniseerd water. Na het scheuren en centrifugeren van de cel, resuspendeert u de pellet in 100 microliter gedeïoniseerd water voordat u deze overbrengt naar een centrifugebuis van 1,5 milliliter. Bevestig vervolgens carbontape aan het oppervlak van een Cambridge-stomp. Pipetteer vijf microliter druppels van de geresuspendeerde celwandsuspensie op de carbontape. Gebruik palladium om de stomp 50 seconden te sputteren nadat u deze een nacht hebt laten drogen. Observeer de cellen op vijf kilovolt, met een geschikte spotgrootte op 10 centimeter van de secundaire elektronendetector. De labeling van de celwand van P. margaritaceum met anti-pectine monoklonale antilichamen onthulde een netwerk van calciumcomplexvezels die een onregelmatig roosterpatroon vormden. De pectine werd afgezet in het centrum van de cel of landengte, waardoor oudere pectine naar de polen werd geduwd. JIM7-labeling toonde aan dat hoog methylveresterde pectine aanvankelijk in een smalle band op de landengte werd uitgescheiden. Andere polymeren in de celwand, zoals arabinogalactan-eiwit, werden gedetecteerd met het monoklonale antilichaam JIM13. Grote hoeveelheden extracellulaire polymere stoffen werden buiten de celwand uitgescheiden, waardoor glijden en celaggregatie mogelijk werden. Labeltechnieken maakten kwantitatieve celwand- en expansiestudies mogelijk, waarbij ontwikkelingsbeeldvormingsbenaderingen werden geïntegreerd. Correlatieve structurele studies toonden aan dat het typische pectinerooster bestond uit een netwerk van vezels dat uitwendig eindigde in verschillende uitsteeksels. Behandeling met hoge concentraties calcium transformeerde het pectinerooster in onregelmatige afzettingen, zoals waargenomen in JIM5-gelabelde cellen. Toen met calcium behandelde celwanden werden onderzocht onder scanning-elektronenmicroscopie, werd de ongeorganiseerde pectinestructuur in detail geobserveerd.