Microdissectie op meerdere niveaus en functioneel-structurele profilering van menselijke renale arteriële takken

Ons onderzoek heeft tot doel gestandaardiseerde methoden vast te stellen om menselijke renale arteriële takken te isoleren en functioneel te beoordelen, mechanismen van vasculaire disfunctie bloot te leggen en gerichte therapieën te begeleiden. Eerder onderzoek was gebaseerd op diermodellen of indirecte beeldvorming, waarbij onze draadmyografie de functie van de menselijke nierslagader in vitro rechtstreeks weerspiegelt. Onze methode maakt nauwkeurige, mensspecifieke vasculaire analyse mogelijk, waardoor soortbeperkingen worden overwonnen en de ontwikkeling van translationele geneesmiddelen wordt verbeterd.

Zorg er om te beginnen voor dat het nierweefsel tijdens het transport volledig ondergedompeld blijft in vloeistof om de levensvatbaarheid van het weefsel en de structurele integriteit te behouden. Identificeer het coronale vlak visueel door het nierhilum te lokaliseren en de snede uit te lijnen om zowel het nierbekken als de laterale convexe rand te passeren. Gebruik een steriel scalpel om de nier langs dit coronale vlak in tweeën te snijden om twee symmetrische helften te creëren en interne structuren bloot te leggen, zoals de nierpiramides en kolommen.

Gebruik onder een stereomicroscoop een microdissectieschaar en een tang om de interlobaire, boogvormige en interlobulaire slagaders zorgvuldig te scheiden in een kweekschaal van 10 centimeter met zwarte bodem. Verwijder vervolgens voorzichtig al het omringende weefsel en vet van de ontlede slagaders in dezelfde 10 centimeter lange kweekschaal met zwarte bodem om ze grondig schoon te maken. Gebruik een microdissectieschaar om de gereinigde slagaders in ringen van ongeveer twee millimeter lang te snijden voor vasculaire functiestudies.

Steek de eerste voerdraad voorzichtig in een arteriële ring in de schaal. Buig een kant van de voerdraad in een hoek van 90 graden en breng de arteriële ring met de draad over in de kamer. Voordat u de arteriële ring op de monsterhouder bevestigt, moet u de lengte van het vat noteren.

Plaats de ring tussen de twee houders en lees de micrometerschaal af, waarbij één schaalverdeling gelijk is aan 10 micrometer. Trek de initiële schaalwaarde af die wordt gemeten wanneer de houders elkaar net raken om de lengte en breedte van de arteriële ring te berekenen. Bevestig vervolgens de arteriële ring op de monsterhouder van het clam-type met behulp van de meegeleverde schroeven van het instrument en draai ze met de klok mee vast.

Rijg vervolgens een tweede voerdraad door de arteriële ring. Wikkel de draad met de klok mee rond de bevestigingsschroeven aan beide uiteinden en bevestig deze stevig aan het oppervlak van de monsterhouder. Selecteer Normalisatie-instellingen in het DMT-menu en stel de oculairkalibratie in op één millimeter per divisie, de doeldruk op 13.3 kilopascal, IC1/IC100 op 0.9, de online gemiddelde tijd op drie seconden en de vertragingstijd op 60 seconden.

Selecteer het kanaal dat overeenkomt met de doelslagader en open het scherm Normalisatie in het DMT-menu. Voer in de daarvoor bestemde velden de eindpunten van het weefsel in, aangezien a1 gelijk is aan nul en a2 gelijk is aan de gemeten vaatlengte in millimeters. Voer de draaddiameter in als 40 micrometer en voer de micrometerwaarde van de schaal in.

Klik op Aanwijs toevoegen om de gegevens op te slaan. Breng nu passief rekken aan en wacht drie minuten. Voer de nieuwe micrometerstand in als het volgende punt en klik op Punt toevoegen.

Voeg vijf milliliter 60 kaliumionenoplossing toe aan de kamer om een kaliumgemedieerde samentrekking van het vat te induceren. Om de 60 kaliumionenoplossing uit te spoelen, voegt u driemaal vijf milliliter Krebs-oplossing toe. Om de door fenylefrine geïnduceerde, concentratieafhankelijke contractie te evalueren, brengt u cumulatief fenylefrine aan in stappen van half log van 10 tot de macht van min negen tot 10 tot de macht van min vier molair.

Was voor aanvullende drugstests de kamer minstens vijf keer met warme vijf milliliter Krebs-oplossing totdat de spanning terugkeert naar de basislijn en gedurende ten minste 10 minuten stabiel blijft. De interlobaire slagader werd met succes ontleed vanuit het niermerg en toonde een dikke vaatwand en omringend vetweefsel dat zorgvuldig moest worden verwijderd om de structurele integriteit te behouden. De boogvormige slagader werd geïsoleerd bij de corticomedullaire overgang en vertoonde een dunnere vaatwand en een gebogen traject.

De interlobulaire slagader werd geïdentificeerd die lineair door de nierschors liep met een zeer dunne wand en nauw geïntegreerd met corticaal weefsel. Histologische analyse toonde aan dat de interlobaire slagader de dikste vaatwand had met een duidelijke adventitia, terwijl boogvormige en interlobulaire slagaders steeds dunnere wanden en minder gladde spierlagen vertoonden. Arteriële normalisatie omvatte herhaaldelijk mechanisch rekken en door kalium geïnduceerde stimulatie, waardoor stabiele basisspanningscondities in alle monsters werden vastgesteld.

Cumulatieve toevoeging van fenylefrine van 10 tot de macht van min negen tot 10 tot de macht van negatieve vier molaire concentraties induceerde progressief sterkere contracties in arteriële ringen op een dosisafhankelijke manier. In vooraf gecontracteerde fenylchorine-slagaders veroorzaakten toenemende concentraties acetylcholine van 10 tot de macht van negatief acht tot drie keer 10 tot de kracht van negatief vijf molair concentratieafhankelijke vasodilatatie.