Een praktische workflow voor de analyse van ruimtelijke transcriptomics-gegevens: van gegevensverwerving tot geavanceerde analyses

Hallo allemaal. In deze video lopen we door een praktische pijplijn voor de analyse van ruimtelijke transcriptomics-gegevens, van gegevensverwerving en -laden tot basisexploratie en tot slot geavanceerde analyse. In totaal bestaat de workflow uit drie hoofstappen.

Ten eerste het downloaden van de gegevens, ten tweede het verkrijgen van de analysecode en ten derde het uitvoeren van de pijplijn om resultaten te genereren. Stap één: gegevensverwerving en de voorbereiding van de mappenstructuur. Verkrijg eerst publieke ruimtelijke transcriptomische datasets.

Download het archief met de ruwe gegevens. Pak het archief uit. Organiseer de bestanden in een gestandaardiseerde mappenstructuur.

Maak eerst een hoofdfilmap voor de gegevens aan en maak vervolgens voor elk monster een specifieke submap. Verplaats de volgende essentiële bestanden voor elk monster naar de respectievelijke submap. Maak daarna binnen elke monsterdirectory een ruimtelijke submap aan.

Plaats de volgende bestanden in de ruimtelijke submap. Plaats het bestand 'filtered feature PC metrics S1' in de hoofdsubmap van het monster. Decomprimeer de gzip-bestanden in de ruimtelijke map.

Zorg ervoor dat de oorspronkelijke bestandsnamen exact zo blijven als vereist door de load 10X spatial-functie. Stap twee, het instellen van de softwareomgeving. Hier slaan we de installatie van de R-taal over en begint de gegevensverwerking met het verkrijgen van het analysescript uit de GitHub-repository.

Installeer de vereiste R-pakketten van Graham in de file conductor door het script setup R uit te voeren. Installeer de auto suit door de installatiecommando's uit te voeren die in het officiële documentblad worden vermeld. Ga naar de officiële installatie-URL om de setup-scripts op te halen. Initialiseer de vereiste Python-omgeving en systemafhankelijkheden volgens de instructies op de setup-pagina.

Verkrijg de aangepaste tool door naar de GitHub-repository te gaan en download de broncode. Ga naar de TOS-directory en installeer de Python-afhankelijkheden. Stap drie: het laden van ruimtelijke gegevens en de kwaliteitscontrole.

Lees de ruimtelijke gegevens in een Seurat-object. Gebruik read 10X image om handmatig de weefselafbeelding met hoge resolutie te laden. Specificeer hierbij de afbeelding en de naam van de afbeelding.

Gebruik de functie load 10X spatial met de image-parameter ingesteld op het image-object dat in de vorige stap is gemaakt en creëer het Seurat-object. Bereken de kwaliteitscontrolemetrieken. Bereken het percentage mitochondriale reads met de functie percentage feature met het patroon mt.

Visualiseer en interpreteer de gegevens op basis van QC-metrieken. Genereer violin plots van nCount_Spatial, nFeature_Spatial en percent.mt met behulp van de violin plot-functie.

Maak ruimtelijke kenmerkplots van deze metrieken met behulp van ruimtelijke kenmerkplots. Identificeer spots buiten het weefselgebied. Optioneel kunnen filters worden toegepast om spots van lage kwaliteit te verwijderen.

Na het uitvoeren van het script kunt u deze resultaten verkrijgen, inclusief QC-metrieken en de ruimtelijke plot van de kenmerken. Stap vier: data-voorbewerking, integratie en clustering. Normaliseer bij de voorbewerking van individuele monsters.

Pas voor elk monster afzonderlijk een SC transform normalisatie toe met assay Spatial. Integreer meerdere monsters. Bereid de lijst met SCTransform-genormaliseerde objecten voor de integratie voor.

Zorg ervoor dat elk object een RNA-assay heeft door de ruimtelijke assay te kopiëren. Gebruik de functies voor selectie-integratie in de PREP SCT-integratie om gedeelde variabele kenmerken te identificeren. Vind de integratieankers met behulp van find integration anchors met de normalisatiemethode SCT.

Integreer de gegevens met behulp van IntegrateData. Voer dimensiereductie uit in de clustering op de geïntegreerde assay. Voer PCA uit op de geïntegreerde gegevens met behulp van runPCA.

Bepaal het optimale aantal hoofdcomponenten voor de daaropvolgende analyse door de cumulatieve verklaarde variantie te berekenen. Identificeer het knikpunt (elbow point) programmatisch. Voer UMap uit met het bepaalde aantal PC's.

Cluster de cellen met behulp van FindNeighbors en FindClusters. Specificeer de bepaalde PC's bij een resolutie van 0,5. Voer een differentiële expressieanalyse uit tussen de doelgroepen met behulp van de FindWorkers-functie.

Identificeer ruimtelijk variabele genen. Voer voor elk oorspronkelijk monster find spatially variable features uit met de Moran's I-methode op de SCT-assay om de ruimtelijke autocorrelatie te berekenen. Na het uitvoeren van dit script kunt u de elbow plot, de UMap-plot, de clusterplot, de heatmap van clustermarkers, de volcano plot, ruimtelijk kenmerk-differentieel tot expressie gebrachte genen, ruimtelijk betrouwbare genen en de markers voor de colonlaag verkrijgen.

En de dot plot van de markers voor de colonlaag, samen met de markers in de ruimtelijke kenmerkenplot. Stap vijf, voorbewerking van enkelcel-referentiedata. Lees de enkelcel RNA-seq count-matrix in met read 10X en maak een Seurat-object aan.

Voer standaard QC-normalisatie en declustering uit. Bereken het percentage mitochondriale reads in de gefilterde cellen. Normaliseer de gegevens met behulp van SC transform.

Stel een vara.to. in, regresseer percent.mt, voer een PCA en UMap uit en cluster de cellen met de dynamische PC-selectiemethode die in de vorige stappen is beschreven, en annoteer vervolgens de celtypen.

Bereken de modulescores voor canonieke celtype-markergenen met behulp van AddModuleScore. Annoteer clusters op basis van de modulescores en bekende biologie. Importeer alternatief vooraf berekende annotaties vanuit metadata.

Na het uitvoeren van dit script kunt u de QC-metrieken verkrijgen. Zij hebben de UMap per cluster, de UMap per monster en de celtypescores geüpload. Stap zes: referentiegestuurde deconvolutie met SPOTlight.

Bereid eerst de gegevens voor voor SPOTlight. Zet het geannoteerde single-cell Seurat-object en het ruimtelijke Seurat-object om in een single-cell experiment-object. Log-normaliseer de single-cell gegevens met behulp van LogMoreCounts.

Voer vervolgens de SPOTlight-deconvolutie uit. Identificeer eerst de genen met een hoge variabiliteit in de single-cell data met behulp van ModelGeneVar. Bereken de celtype-markers met behulp van score markers en filter op markers van hoge kwaliteit.

Downsample de single-cell referentie voor elk celtype naar een hanteerbaar aantal om de rekentijd te verkorten. Voer de deconvolutie uit met de SPOTlight-functie door de single-cell referentie, de spatiale gegevens, de markerlijst en de HVG's op te geven, waarna we de resultaten kunnen visualiseren en exporteren. Het deconvolutieresultaat kan als volgt worden verkregen, weergegeven als een scatter pipe route.

Stap zeven, ongesuperviseerde deconvolutie met Stdeconvolve. Bereid eerst de ruimtelijke gegevens voor. Extraheer de metrieken van het aantal rijen uit het ruimtelijke Seurat-object met GetAssayData met de slot counts.

Verwijder spots en genen van lage kwaliteit met behulp van de opgeschoonde counts van STdeconvolve. Identificeer de latente celtypen voor de filters waarbij een corpus van vier genen in een minimale fractie van de spots tot expressie komt via restrict strict LDA door dit allocatiemodel over een reeks potentiële topic-aantallen toe te passen met fitLDA. Selecteer het optimale model op basis van minimale complexiteit met behulp van optimal model met opt min.

Analyseer en visualiseer de resultaten. Extraheer het serotype-aandeel, Theta, en de genprofielen Beta voor het optimale model met behulp van getBetaTheta. Om een biologische interpretatie van de corrosieonderwerpen toe te voegen, importeert u de annotaties van het interessegebied die zijn gegenereerd door de tool voor het selecteren van ruimtelijke spots.

Gebruik deze annotaties als groepsparameter in de functie 'with all topics'. Projecteer de gedeconvolueerde celtype-proporties van uw project terug op de ruimtelijke coördinaten en kleurcodeer de spots op basis van hun ROI. Na het uitvoeren van het script krijgt u een resultaat zoals dit, een schaalbare weergave, vergelijkbaar met die van SPOTlight.

Stap acht, ruimtelijke cel-celcommunicatie met behulp van Giotto. Zet eerst het Seurat-object om in een Giotto-object. Gebruik hiervoor de functie createGiottoObject en voeg de low-count metrics en de ruimtelijke coördinaten toe.

Voorbehandel het Giotto-object en voeg het deconvolutieresultaat toe. Normaliseer de gegevens met behulp van normalized Giotto en voeg deze toe als serotype-annotaties. Selecteer celmetadata met behulp van addCellmetadata.

Creëer een ruimtelijk netwerk met behulp van createSpatialNetwork. Laad een ligand-receptor-database in onze omgeving. Voer explore CellCellcom uit om significante ligand-receptorinteracties te identificeren tussen celtypen die zich in ruimtelijke nabijheid bevinden.

U kunt de dot plot voor cel-cel communicatie als volgt verkrijgen. Stap negen is optioneel. Interactieve selectie van spots met SelectSpatialSpot.

Bereid de gegevens voor de interactieve tool voor met behulp van het script six. Extraheer de ruimtelijke coördinaten uit het Seurat-object met GetTissueCoordinates. Formatteer en exporteer de gegevens.

Exporteer het formatieve dataframe naar een CSV-bestand. Voer vervolgens een analyse van het interessegebied uit. Start de aangepaste applicatie.

Selecteer de applicaties voor ruimtelijke spots en laad het CSV-bestand. Selecteer interactief de spots op basis van de ruimtelijke locatie. Exporteer vervolgens de lijst met geselecteerde spots en hun toegewezen groep als een nieuw CSV-bestand.

We controleren nu wat we verkrijgen na het één voor één uitvoeren van het script. Alle resultaten worden opgeslagen in de resultaten van de vijfvoudige kruisvalidatie. En zoals u kunt zien, kunnen we de QC-metrieken en de verdeling verkrijgen.

En u kunt hier de ruimtelijke kenmerkplot bekijken. Bovendien is het deconvolutieproces zowel op een gesuperviseerde als een ongesuperviseerde manier uitgevoerd. De SPOTlight-resultaten vindt u hier.

Zoals u kunt zien, bevatten alle spots de proportie-informatie. De resultaten van de ongesuperviseerde deconvolutie door STdeconvolve zijn hier ook gegenereerd. En dit is het Seurat-clusterresultaat van de spot in de ruimtelijke data.

U kunt ze ook visualiseren in de ruimtelijke teamplot, zoals hier. Bovendien kunt u met Giotto ook de resultaten van de spot-spot communicatie verkrijgen. Deze volledige workflow is 100% open source.

Spotting-analyse van expressiemetrieken tot geavanceerde ruimtelijke modellering. Alle stappen worden uitgevoerd op een machine met 16GB RAM. De codebasis is modulair, met één script per taak.

Houd er rekening mee dat deze pipeline de upstream-verwerking vanuit de FASTQ-bestanden niet omvat. De focus ligt op de 2D-ruimtelijke gegevens en momenteel worden alleen de downloaders van Visium ondersteund. Dat is alles, bedankt voor het kijken.