Lipid-eiwitmembraan structuur-functie karakterisering met behulp van druppelinterface-dubbellagen

In dit werk bestuderen we hoe de fysieke en elektrische eigenschappen van lipidemembranen en hun omgeving de ionengeleiding in druppelgrens-bilayer modelsystemen beïnvloeden. Traditionele patch clamp-elektrofysiologie onderzoekt geen grootschalige membraanbiofysica, maar dit enkele platform vangt zowel enkelkanaalactiviteit als membraangebieden die groter zijn op millimeterschaal om membraanbiofysica uitgebreider te bestuderen. Om te beginnen bereid je de met chloor, agarose gecoate zilverdraadelektroden en lipideblaasoplossingen voor elektrofysiologische experimenten.

Voor de vorming van druppelinterface-dubbellaag, plaats je een heldere onderste Petrischaal op het niveau van een omgekeerde microscoop. Vul de schaal met alkaanolie zoals 100% hexadecane tot een diepte van ongeveer vijf millimeter. Na het bevestigen van de elektroden aan het patchclamp-hoofdpodium en de aardelektrodehouder, gebruik je de micromanipulatorbediening om beide met agarose gecoate baluiteinden in de olie te laten zakken tot een diepte van ongeveer 2,5 millimeter onder het olieoppervlak, waarbij snelle bewegingen worden voorkomen om botsingen met de petrischaal te voorkomen.

Stel de microscoopfocus aan totdat beide baluiteinden en hun agarosecoatings scherp scherp zijn. Plaats de elektroden dicht bij de rand van het gezichtsveld, zodat beide gelijktijdig kunnen worden waargenomen. Met een gekalibreerde pipet van twee microliter aspireert u de geëxtrudeerde DPhPC-lipideblaasjes die zijn gedopeerd met gramicidine A. Doseer langzaam 250 nanoliter van de suspensie direct op elk agarose-gecoate boluiteinde met een aparte pipettip voor elk zonder de agaroseschaal aan te raken.

Laat de druppels zich over het agaroseoppervlak verspreiden en zichtbaar naar beneden zakken door de zwaartekracht en verminderde oppervlaktespanning, waardoor een hangende druppelvorm ontstaat. Let op het doorzakken van de zijkant door de petrischaalwand als het helder is. Na vijf minuten duw je voorzichtig tegen de anti-vibratietafel om de druppel te beoordelen.

Bevestig dat de doorhangende druppels met een lichte vertraging bewegen ten opzichte van de elektrodebeweging, wat wijst op de vorming van volledig gecoate lipidemonolaagdruppels. Als dit gedrag niet wordt waargenomen, wacht dan nog eens twee tot drie minuten en herhaal de beoordeling. Zorg ervoor dat de microscoop, anti-vibratietafel, Faraday-kooi, versterker, digitizer, functiegenerator en computer op een gemeenschappelijke aarde zijn aangesloten.

Organiseer de instrumentverbindingen volgens de opstellingsgids van de fabrikant en configureer de essentiële elektrische en optische opstelling, volgens de gedetailleerde instructies voor druppelinterface-bilayerexperimenten. Configureer een externe functiegenerator of het uitvoerkanaal van de acquisitiesoftware om een 10-Hertz, 10-millivolt driehoeksgolfvorm te genereren. Bevestig de amplitude en frequentie op een aangesloten oscilloscoop en in de acquisitiesoftware.

Nadat de druppels ongeveer 10 minuten hebben gehangen, gebruik je de micromanipulatoren om de twee druppels zacht in contact te brengen. Zet de 10-Hertz, 10-millivolt driehoeksgolfvorm aan en monitor de capacitieve stroomrespons in de acquisitiesoftware. Pas het druppelcontactoppervlak aan door de elektroden licht te verplaatsen totdat de piek-tot-piek capacitieve stroomrespons op de golfvorm tussen ongeveer 100 en 200 picoampère ligt.

Of het contactoppervlak is niet groter dan ongeveer 1/4 van de druppeldiameter. Wacht op spontane vorming van een dubbellaag, elektrisch aangegeven door een expanderende piek-tot-piek capacitieve stroomrespons en optisch door een toenemende interne reflectie met een ovale uitstraling in het contactgebied. Bevestig dat zuivere lipide-dubbellagen rechthoekige stroomplateaus vertonen als reactie op de driehoekige spanningsstimulus, terwijl gramicidine A-gedopeerde dubbellagen hellende plateaus vertonen, wat ensemble-ionische geleiding weerspiegelt.

Zodra stabiel-capacitieve of geleidende responsen zijn bevestigd, schakel de driehoekgolfvorm uit en laat de druppelinterface-dubbellaag minstens 15 minuten in evenwicht zijn voordat stimulatieprotocollen worden toegepast. In de video-opnamesoftware stel je de framerate in op minstens 20 frames per seconde. Selecteer de juiste camera- en objectieflensinstellingen.

Klik vervolgens op Acquisiteren en selecteer Nieuw Protocol. Selecteer in het tabblad Acquisitiemodus Episodische Stimulatie. Stel runs per trial in en sweeps per run tot één.

Pas de sweep-duur aan op vier seconden langer dan de totale experimentele duur, zodat er een baseline van twee seconden vóór en na de stimulus mogelijk is. Stel de bemonsteringsfrequentie in op tussen de vijf en tien kilohertz. Wijs in het tabblad Ingangen het opnamekanaal toe aan de huidige ingang.

En dan, in het tabblad Uitgangen, wijs je het stimulatiekanaal toe aan de spanningsuitgang die de elektroden aanstuurt. Open het tabblad Waveform. In kolom A zet je type op Stap, eerste niveau en delta-niveau op nul millivolt, en eerste duur op 2.000 milliseconden om een pre-stimulatiebaseline te definiëren.

In kolom B stel je type Pulse in voor gepaarde pulsfacilitatie. Specificeer de waarden voor de eerste duur en de amplitude van de eerste spanning en stel de treinsnelheid in om het interpulsinterval te definiëren dat overeenkomt met de doelduty cycle. Stel de pulsbreedte aan op 100 milliseconden.

In kolom C, voor gepaarde pulsdepressie, stel je type in op Puls met dezelfde amplitude en pulsduur. Stel de treinsnelheid in om de gewenste lagere duty cycle te bereiken en stel de pulsbreedte in. Vervolgens configureer je in kolom D de poststimulatieparameters die identiek zijn aan de pre-stimulatiebasislijn.

Bekijk het protocol en sla het op met een beschrijvende naam. Begin met video-opname en start direct elektrische opname en stimulatie door op de Opnameknop in elke software te klikken. Let tijdens de eerste 60 seconden van stimulatie op dat de stroom toeneemt en een plateau kan bereiken.

Let op dat de stroom afneemt in de laatste 60 seconden. Stop aan het einde van het protocol gelijktijdig met elektrische acquisitie en video-opname. Voer tenslotte nabewerking uit om membraanoppervlak te extraheren en de genormaliseerde stroom, oppervlakte en flux te berekenen uit beeldvormings- en elektrische gegevens.

Opeenvolgende beelden legden spontane dubbellaagritsen en gebiedsuitbreiding vast wanneer twee doorhangende druppels in contact kwamen. De heldere ovale binnenste reflecties bij het druppelcontact werden gebruikt om de diameter van de dubbellaag en het membraanoppervlak in de tijd te schatten. Gepaarde pulsfacilitatie van nul seconden tot 60 seconden en gepaarde pulsonderdrukken van 60 seconden tot 120 seconden werden geleverd met pulsen van 100 milliseconden.

De representatieve huidige responsen tijdens bepaalde periodes en de stimulatiepatronen werden geregistreerd. Genormaliseerde stroom voor gramocydine A-gedopeerde DPhPC-dubbellagen in hexadecane en dodecane/hexadecane oliën wordt getoond tijdens gepaarde pulsfacilitatie en gepaarde pulsdepressie. Genormaliseerd membraanoppervlak gemeten op 30 tijdstippen toonde een vergelijkbare gebiedsevolutie in beide oliecondities, ondanks verschillende stromingen.

Genormaliseerde flux scheidde oppervlakte-onafhankelijke veranderingen in conductantie en was consistent met veranderingen in membraangeleiding buiten eenvoudige oppervlakteexpansie. Langdurige gepaarde pulsdepressiestimulatie tot 30 minuten veroorzaakte langdurig depressieachtig gedrag in hexadecane membranen, maar handhaafde verhoogde flux in dodecane/hexadecane membranen die consistent is met langdurig potentiatie-achtig gedrag. Dit protocol stelt ons in staat te meten hoe membraanstructuur en ionengeleiding veranderen door elektrisch aangedreven herstructurering van druppelinterface-dubbellagen.

Dit platform kan veel verschillende stimulatieprotocollen ondersteunen met recht op ionenkanalen, zonder ionkanalen, en zelfs fotoisomeriseerbare kanalen om membraandynamica en elektrische eigenschappen beter te onderzoeken. Omdat dit afstembare platform zowel de membraanbiofysica op macroschaal als op microschaal onderzoekt, zouden toekomstige experimenten aanzienlijk verbeteren door fluorescentiespectroscopie te gebruiken om eiwitkanaalactiviteit zekerder te scheiden van membraanporiegeleiding.