Kwantificatie van NK-cel cytotoxiciteit versterkt door chimerische antigeenreceptoren en therapeutische antilichamen met behulp van live-cell imaging en flowcytometrie

Ons laboratorium bestudeert de rol van natural killer-cellen bij gezondheid en ziekte, met als doel hun potentieel te benutten om behandelingen voor solide tumoren en bloedkankers te verbeteren. Bestaande assays voor de cytotoxiciteit van NK-cellen missen standaardisatie over verschillende platforms en opstellingen heen. Dit protocol biedt reproduceerbare methoden voor live-cell imaging en flowcytometrie voor een nauwkeurige bepaling van de cytotoxiciteit.

Begin met het bereiden van 10 milliliters 2x SYTOX Orange door de SYTOX Orange-stamlopulutie te verdunnen in NK-92-kweekmedium in een centrifugebuis van 15 milliliter met een conische bodem. Tel de doelcellen met een Luna Counter na menging met Trypan Blue of gebruik een andere gevalideerde methode voor celtelling op basis van kleurexclusie. Breng de benodigde hoeveelheid doelcellen over in een centrifugebuis van 15 milliliter met een conische bodem.

Centrifugeer de buis 5 minuten bij 300G op kamertemperatuur en verwijder het supernatant. Resuspendeer vervolgens de doelcellen tot een uiteindelijke concentratie van 250.000 cellen per milliliter in 2X SYTOX Orange medium. Beoordeel voor de voorbereiding van de effectorcel de viabiliteit en concentratie van de NK-92 cellen, en ga alleen verder als de viabiliteit hoger is dan 80%, aangezien een lagere viabiliteit de prestaties van de assay kan beïnvloeden.

Tel het benodigde aantal NK-92-cellen en breng deze over in individuele centrifugebuizen van 15 milliliter met een kegelvormige bodem. Resuspendeer de cellen na centrifugatie tot een uiteindelijke concentratie van 500 000 cellen per milliliter. Bereid verdunningen van effectorcellen voor door 240 microliters effectorcellen toe te voegen aan de wells van een 96-wells plaat met ronde bodem voor de effector-target-ratio van twee op één, en voeg 120 microliters medium toe aan de overige wells.

Voer tweevoudige seriële verdunningen uit van effector-doelwitverhoudingen van 2:1 tot 1:1 tot 0,25:1, waarbij grondig wordt gemengd door ten minste vijf keer te pipetteren en de tips tussen de overbrengingen worden gewisseld. Neem vervolgens de met polylysine gecoate 96-wellplaat met platte bodem om de co-cultuur op te zetten. Resuspendeer de doelwit- en effectorcellen vlak voor de overdracht grondig zonder bellen te vormen, en voeg vervolgens 100 µL van elke cel-suspensie toe aan de betreffende wells.

Voeg vervolgens 200 µL PBS toe aan de omliggende ongebruikte wells. Centrifugeer de plaat bij 100G gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Plaats de plaat in het live-cell imaging-systeem.

Neem elke uur gedurende 24 uur beelden op bij 37 °C met 5% koolstofdioxide. Controleer de beeldkwaliteit na de eerste scan en pas indien nodig de beeldinstellingen aan. Pas de spectrale ontmenging aan om spillover van SYTOX Orange naar het groene kanaal te corrigeren.

Verifieer dat oranje positieve dode cellen niet onterecht worden geïdentificeerd als groen positieve cellen. Om de cel-voor-cel-analyse van niet-adherente cellen te configureren, stelt u de verwachte objectdiameter in op 15 micrometers om overeen te komen met de geschatte celdiameter. Stel de drempelsensitiviteit en textuursensitiviteit in op vijf, en de randensensitiviteit op 10 om de scheiding van celclusters te vergemakkelijken.

Stel het filterbereik voor het geaccepteerde objectoppervlak in op 50 tot 2.000 vierkante micrometer om debris en grote objecten uit te sluiten. Stel de maximale excentriciteit in op 0,95 om niet-cellulaire objecten uit te sluiten. Gebruik primaire humane NK-cellen die gedurende 16 tot 24 uur zijn gekweekt.

Breng 500, 000 doelcellen over in een conische centrifugebuis van 15 milliliter. Was de cellen één keer met 10 milliliters PBS. Centrifugeer de cellen bij 300G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Verwijder vervolgens het supernatant. Bereid een werkoplossing van 0,5 µM carboxyfluoresceïne-succinimidylester of CFSE in PBS door één µL van de 5 mM CFSE-stamoplossing te verdunnen in 10 mL PBS. Resuspendeer het verkregen pellet in de CFSE-oplossing op een concentratie van ongeveer één miljoen cellen per mL.

Incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij 37 °C, gewikkeld in aluminiumfolie om ze tegen licht te beschermen. Stop vervolgens de reactie door vijf tot 10 volumes kweekmedium toe te voegen en incubeer gedurende vijf minuten bij 37 °C. Na het centrifugeren van de cellen wordt de celpellet opnieuw gesuspendeerd op 250.000 cellen per milliliter, zodat 100 µL 25.000 cellen bevat.

Voeg met een meerkanaals pipet 100 µL doelcellen per well toe aan de aangewezen wells van een 96-wells plaat met ronde bodem. Zet elke conditie in triplikaat op. Bereid vervolgens voor elk testantilichaam en bijbehorende isotypecontrole 200 µL 4X antilichaamoplossing voor in NK-celkweekmedium.

Overbreng de antilichaamoplossingen naar een deep well plate. Voeg 50 µL antilichaamoplossing toe aan elke well met de doelcellen en meng dit grondig door ten minste vijf keer te pipetteren. Voeg 50 µL NK-cel kweekmedium per well toe aan de controle-wells zonder antilichaam en meng dit grondig door te pipetteren.

Incubeer de plaat gedurende 25 tot 30 minuten onder standaard incubatieomstandigheden. Tel de cellen en verkrijg 200.000 NK-cellen; ga alleen verder als de levensvatbaarheid groter is dan of gelijk is aan 75%. Resuspendeer de cellen tot 250.000 cellen per milliliter in 800 µL primair humaan NK-celkweekmedium. Voeg per putje 50 µL NK-cellen toe aan de overeenkomstige putjes en meng grondig door ten minste vijf keer op en neer te pipetteren.

Pipette vervolgens 50 µL kweekmedium per putje in de controleputjes en meng dit grondig. Inspecteer de 96-wells plaat met ronde bodems zorgvuldig om te bevestigen dat alle putjes 200 µL bevatten met uniforme meniscusniveaus en zonder luchtbellen. Centrifugeer de plaat gedurende twee minuten bij 100G en incubeer deze vervolgens gedurende 16 tot 18 uur onder standaard incubatieomstandigheden.

Centrifugeer de plaat gedurende vijf minuten bij 300G en verwijder het supernatant. Was alle wells met 200 µL per well fluorescence-activated cell sorting- of FACS-buffer. Bereid een mastermix van oppervlakte-antilichamen in FACS-buffer voor zoals hier beschreven.

Resuspendeer de cellen in 50 µL per well van de antilichaam-mastermix en meng grondig door minstens vijf keer op en neer te pipetteren. Incubeer de plaat gedurende 15 minuten bij 4 °C, gewikkeld in aluminiumfolie om deze tegen licht te beschermen. Voeg 150 µL FACS-buffer per well toe.

Resuspendeer de cellen na centrifugatie in 100 µL per well van 5 µM DAPI in FACS-buffer. Ga onmiddellijk over tot flowcytometrie-acquisitie zonder incubatie voorafgaand aan de acquisitie. Voer de flowcytometrie uit met het Cytek Aurora-instrument en registreer de fluorescentiekanalen voor CFSE, BV421, BV785, PE-Cy7, DAPI en eventuele aanvullende fluoroforen.

Tijdens de co-cultuur werden effectorcellen, levende doelcellen en dode cellen gevisualiseerd met behulp van real-time live-cell microscopie. CAR2- en CAR3-NK-92-cellen vertoonden een snellere killing-kinetiek dan CAR1-NK-92-cellen, met name op vroege tijdstippen bij een gelijke effector-doelcelratio. De doding van doelcellen nam toe bij hogere effector-doelcelratio's, inclusief controle NK-92-cellen, die natuurlijke cytotoxiciteit vertoonden.

CAR2- en CAR3-NK-92-cellen vertoonden een grotere potentie bij lagere effector-doelwitverhoudingen op latere tijdstippen. Daarentegen werd op eerdere tijdstippen een verhoogde potentie waargenomen bij gemiddelde effector-doelwitverhoudingen. Drie parameters, KR50, KT50 en IKI-50, werden gedefinieerd om de potentie van CAR-NK-92-cellen, de kill-kinetiek en de algehele cytotoxische prestaties over effectorpopulaties te kwantificeren.

De toevoeging van alleen daratumumab verminderde de overleving van de doelcellen niet, wat bevestigt dat het antilichaam geen direct effect had op de levensvatbaarheid van de doelcellen in afwezigheid van effectorcellen. Co-cultuur met alleen NK-cellen verminderde de overleving van de doelcellen tot ongeveer 70%, wat wijst op een baseline natuurlijke cytotoxiciteit. De toevoeging van daratumumab verminderde de celoverleving verder tot ongeveer 37%, wat consistent is met een verhoogde antilichaam-gemedieerde cytotoxiciteit.

Daarentegen vertoonde de isotype-controleconditie een overleving van ongeveer 62%, wat vergelijkbaar was met de conditie met enkel NK-cellen. De degranulatie van NK-cellen was het laagst in de co-cultuur van NK-cellen en doelcellen zonder antilichaam en het hoogst in de met daratumumab behandelde conditie met ongeveer 31%, terwijl de isotype-controle een tussenliggende degranulatie vertoonde van ongeveer 19%. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om de natuurlijke cytotoxiciteit van NK-cellen te kwantificeren, de tumor-dodend vermogen van CAR-NK-ontwerpen te evalueren en de ADCC-efficiëntie van monoclonale antilichamen te vergelijken. Een belangrijk aandachtspunt bij het uitvoeren van dit protocol is het handhaven van nauwkeurig en consistent tellen, pipetteren en uitplaten van NK- en doelcellen om betrouwbare en interpreteerbare resultaten te garanderen.

Toekomstige studies kunnen deze protocollen gebruiken om immuunontwijking door NK-cellen te onderzoeken, tumorgevoeligheid te vergelijken en nieuwe op NK-cellen gebaseerde immunotherapieën bij verschillende soorten kanker te evalueren.