Peilen naar Mitochondriale complexe activiteit in menselijke embryonale stamcellen

Mitochondriën vervullen talrijke rollen in de celphysiologie, van metabolisme en energieproductie tot geprogrammeerde celdood en de synthese van steroïdhormonen. Ondanks het belang van mitochondriën voor zowel fundamentele cellulaire functies als ziektebeelden, is er zeer weinig bekend over de functie van mitochondriën in menselijke embryonale stamcellen en hun gedifferentieerde nakomelingen. In deze video laten we u zien hoe de complexen van de mitochondriale ademhalingsketen van menselijke embryonale stamcellen kunnen worden geanalyseerd met behulp van Ingel-activiteitsassays.

Hallo, ik ben Ivan OV van het laboratorium van Michael Tetel van de afdeling Pathologie en Laboratoriumgeneeskunde aan de University of California Los Angeles. Vandaag laten we u een procedure zien voor het beoordelen van de functie van mitochondriële respiratoire complexen in menselijke embryonale stamcellen. Deze in-gel activiteitsanalyse omvat de isolatie van ruwe mitochondriële fracties uit menselijke embryonale stamcellen, de scheiding van mitochondriële complexen van het oxidatieve fosforyleringssysteem met hoge resolutie clear native polyacrylamidegelelektroforese en de daaropvolgende in-gel activiteitsanalyse.

Laten we beginnen. De eerste stap in deze procedure is het isoleren van mitochondriën uit humane embryonale stamcellen. Voor deze analyse gebruiken we humane embryonale stamcellen die zijn gekweekt op een met matrigel bedekte plaat onder feeder-vrije omstandigheden.

Om mitochondriën te isoleren uit onze menselijke amry-stamcellen, beginnen we met het wassen van de cellen met warm 1x PBS pH 7.4, waarna we de cellen vijf minuten trypsiniseren. U kunt 1 mL 1x trypsine per putje in een six-well plaat gebruiken. Na vijf minuten kan de reactie worden gestopt door een gelijk volume verse trypsine-inhibitor (1 mg/mL in 1x PBS) toe te voegen, waarna de cellen kunnen worden geoogst.

De verzamelde cellen worden vervolgens gecentrifugeerd bij 200 ×g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Gooi na het centrifugeren het supernatant weg en resuspendeer de pellet van de cellen in 0,8 tot 1,7 milliliters ijskoud mitochondriën-isolatiebuffer met een vers bereide cocktail van één x protease-inhibitor. De hoeveelheid buffer die u gebruikt, is afhankelijk van de grootte van de verkregen celpellet. Nadat de pellet is geresuspendeerd, wordt deze ongeveer 10 minuten op ijs geïncubeerd.

Na de incubatie breken we de cellen af met een homogenisator; dit kan ongeveer 40 tot 50 slagen duren. We kunnen de volledigheid van de homogenisatie controleren door een aliquot van de DOD-cellen te kleuren met trypaanblauw en deze onder een lichtmicroscoop te bekijken. Het zou er ongeveer zo uit moeten zien.

Dit is de eerste opname na 50 slagen met een downs. Dit is de tweede opname na 80 slagen met een downs. Zodra de cellen gehomogeniseerd zijn, centreer deze vervolgens bij 20,000 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Dit resulteert in een ruw mitochondriaal pellet, waarin ook kernen en grotere celfragmenten aanwezig zullen zijn.

Voordat het pellet wordt verzameld, moeten we de opvangbuis wegen om het daaropvolgende pelletgewicht te kunnen schatten, het supernatant afgieten en weggooien, en vervolgens het neergeslagen ruwe mitochondriële pellet wegen. Door het gewicht van de buis op dit punt af te trekken, kan men overgaan tot het solubiliseren van het pellet, wat in de volgende stap wordt getoond. Om het ruwe mitochondriële pellet te solubiliseren, beginnen we door het pellet op ijs te houden en te vortexen met 35 µL ijskoud solubilisatiebuffer.

Voor elke 20 mg pellet waarover we gedetailleerde informatie hebben, worden de buffercomponenten vermeld in het bijbehorende schriftelijke protocol. Na het vortexen en het toevoegen van solubilisatiebuffer, en vóór het toevoegen van digitonin, brengen we de geresuspendeerde pellet over in een buis die geschikt is voor hogesnelheidscentrifugatie; vervolgens voegen we 20 µL 10% (w/v) digitonin toe per 20 mg pelletgewicht en mengen we door met de buis te tikken. Nadat het mengsel grondig is gemengd, wordt de mitochondriale pellet vijf tot 10 minuten op ijs geïncubeerd. Dodecylmaltoside (DDM) of Triton X-100 kan in de plaats van digitonin worden gebruikt om eiwitten te solubiliseren.

De keuze van het detergent en de hoeveelheid ervan kunnen de vorming van supracomplexen of multimere vormen van mitochondriale complexen beïnvloeden na incubatie op ijs. Zodra het pellet is gesolubiliseerd, centrifugeren we dit 15 minuten bij 100.000 ×g bij 4 °C, waarna we de heldere supernatant verzamelen. We kunnen nu de supernatant voorbereiden voor het aanbrengen op onze gradiëntgel voor native gradiëntgelelektroforese van mitochondriën.

Wij raden het gebruik aan van een acrylamide-gradiëntgel van vijf tot 13% met een stackinggel van 3,5%. Voor de bereiding van de gel gebruiken we een acrylamide-bisacrylamide-mengsel zoals beschreven in het geschreven protocol. De acrylamide-bisacrylamide-oplossing wordt vooraf bereid en bewaard bij vier graden Celsius op een donkere plaats.

Acrylamide en bis-acrylamide zijn toxische chemicaliën, zowel in poedervorm als in vloeibare vorm, dus er moet speciale aandacht worden besteed bij het werken ermee. We combineren de acrylamide-bis-acrylamide-oplossing met een aliquot van drie x gelbuffer bestaande uit 1,5 M 6-aminocapronzuur en 75 mM OLET bij pH 7,0. De hoeveelheid acrylamide-bis-acrylamide-oplossing die we aan de buffer toevoegen, is afhankelijk van het gelpercentage dat we gebruiken om de gradiëntgel te maken.

We maken één 4%mengsel en één 13%mengsel, en de stapelgel wordt een 3,5%mengsel. Vergeet niet om glycerol aan het 13%mengsel toe te voegen. Wanneer alle drie de mengsels klaar zijn, voegen we een passende hoeveelheid ammoniumpersulfaat en TEMED aan de mengsels toe en gieten we de mengsels in een castingkamer voor gradiëntvorming.

Het linkergedeelte van de kamer bevat de 5%mix. Het rechtergedeelte van de kamer bevat de 13%mix met een klein magnetisch roerstafje. We beginnen met het gieten van de gel door het rechtergedeelte van de kamer te openen.

Vervolgens openen we onmiddellijk het linkergedeelte van de kamer en laten we de 5% oplossing mengen met een 13% oplossing om de gradiënt te vormen. We voegen een kleine hoeveelheid isopropanol toe aan de bovenkant van de gel om na polymerisatie een scherpe, rechte rand voor de gel te vormen. Ongeveer een uur later, wanneer de polymerisatie van de gradiëntgel voltooid is, verwijderen we de isopropanol, gieten we de 3.5 stacking gel in het apparaat en plaatsen we een gelkam.

We zullen de gels assembleren en laten lopen in een koelruimte van ongeveer vier tot zeven graden Celsius. Voor het laten lopen van deze gel gebruiken we twee verschillende buffers. In de anodekamer gebruiken we een buffer die 25 millimolar ole zoutzuur pH 7.0 bevat.

De kathodebuffer bevat 50 millimol Tris, 7,5 millimol zoutzuur, 0,02% gewicht per volume n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) en 0,05% gewicht per volume desoxycolaat bij pH 7,0. Om het supernatant voor te bereiden voor applicatie op de zojuist gegoten gel, wordt ladingsbuffer toegevoegd om een eindconcentratie van 5% gewicht per volume glycerol en 0,01% gewicht per volume NP-40 te verkrijgen; gewoonlijk voegen we een 10x stockoplossing met glycerol en NP-40 rechtstreeks toe aan de supernatanten.

Nu zijn we klaar om het monster op de gel te laden. We vullen de gelputjes met een volume dat 20 tot 40 mg van het ruwe mitochondriële eiwit per lane bevat. Direct na het laden wordt de gel gerund bij 100 volt.

Zodra het monster in de stapelgel is geïntroduceerd, kan het voltage worden verhoogd naar 500 volt, met een stroombeperking van 15 milliampère. Hoewel we de gel gewoonlijk gedurende de nacht draaien bij 70 tot 100 volt, stoppen we de elektroforese wanneer een scherpe lijn van de rode zos-kleurstof het gelfront nadert. Nu de gel is gedraaid, kunnen we de activiteit van verschillende proteïnecomplexen direct in de gel analyseren.

De incubatietijd voor elke assay is afhankelijk van de efficiëntie van de eiwitsolubilisatie en de hoeveelheid materiaal die per putje wordt geladen. Complexen één, vier en vijf leveren gewoonlijk sterkere signalen op dan complexen twee en drie. Daarom moet de kleuringstijd voor complex twee en drie langer zijn.

Om de complexactiviteit te testen, moeten we specifieke buffers voor elk complex gebruiken. De ingrediënten voor de afzonderlijke buffers vindt u in het schriftelijke protocol. We zullen nu afzonderlijke banen uit de gel knippen om de in-gel activiteitsassays afzonderlijk uit te voeren.

Incubeer voor alle complexen, behalve voor complex vijf, de gelplak enkele uren bij kamertemperatuur in de respectievelijke buffers. Fixeer de gel na incubatie gedurende 15 tot 45 minuten in 50% methanol en 10% azijnzuur. De gefixeerde gel wordt bewaard in 10% azijnzuur.

Hier ziet u hoe de kleuring van complex één eruitziet. Er is één dieppaarse band in de gelplak die overeenkomt met complex één. Heldere gels maken het mogelijk om densitometrie uit te voeren op de activiteiten van mitochondriële complexen en vergelijkende analyses te maken.

Na de dichte cytometrie drogen we de gelsecties gewoonlijk voor langdurige bewaring en/of voor scanning om een kwalitatief hoogwaardig beeld te verkrijgen; complex twee heeft dezelfde paarse kleur als complex drie en complex vier. Beiden geven een oranje of gelige kleuringsband. Hier zijn voorbeelden van de kleuringsactiviteiten van complex twee, drie en vier.

We hebben zojuist aangetoond hoe de activiteit van mitochondriale exudatieve activeringscomplexen kan worden geanalyseerd, welke werden geëxtraheerd uit menselijke embryonale stamcellen en gescheiden met een hogere resolutie, waaronder native gelelektroforese. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.