Neutrofielen Isolatie Protocol
23 juli 2008
Neutrofielen behoren tot de eerste cellen aan te komen op de site van inflammatoire immuunrespons, en hun functies en mechanismen zijn uitgebreid bestudeerd in vitro. Demonstreren we een standaard dichtheidsgradiënt scheidingsmethode voor de menselijke neutrofielen isoleren van volbloed met in de handel verkrijgbaar scheiding media.
Protocol voor de isolatie van neutrofielen. Deze procedure wordt gebruikt om witte bloedcellen uit een volbloedmonster te extraheren met behulp van een centrifuge en buisjes. Vortexmixer, naald en spuit, spuitenfilter.
Materialen van het merk Milli Pore MX gv 0,22 micrometer. De scheiding van neutrofielen met Hanks gebalanceerde zoutoplossing vereist twee soorten HBSS-oplossingen. HBSS met calciumchloride wordt gebruikt om een oplossing met humaan serumalbumine te maken.
HBSS zonder calciumchloride wordt gebruikt om de neutrofielen te suspenderen en te wassen. Let er specifiek op dat de juiste HBSS-oplossing bij deze procedure wordt gebruikt. Humane serumalbumine of HSA is een eiwit in het bloedplasma dat de pH en de osmotische druk handhaaft.
Gebruik geen bovine serum amalgamate red cell lysis buffer. Deze wordt geproduceerd door Roche Diagnostics, neutrophil Isolation Media NIM Cedar Line Labs Lymph light Poly separation media; bescherm tegen licht en bewaar in de koelkast voor het beste resultaat. Alle reagentia moeten op kamertemperatuur zijn op het moment van gebruik.
Haal de reagentia één uur voor het experiment uit de koelkast. Bereid de H-B-S-S-H-S-A-oplossing voor voor de scheiding van neutrofielen. Pipetteer HBSS met calciumchloride in een vial.
Trek HSA op in de spuit. Voorkom dat er luchtbellen bekneld raken. Verwijder de naald van de spuit en vervang deze door het filter.
Injecteer HSA via een filter in een HBSS-buisje en meng dit door twee keer te vortexen. Wanneer de overige materialen gereed zijn en op kamertemperatuur zijn, verzamel dan ongeveer 15 milliliter volbloed. Dit levert 10 tot 15 milliliter op met 10⁸ neutrofielen. De donor mag gedurende 24 uur voorafgaand aan de afname van het bloedmonster geen alcohol of vrij verkrijgbare geneesmiddelen hebben gebruikt.
Deze kunnen het scheidingsproces verstoren. Volledig bloed kan worden anticoaguleerd met EDTA-citraat of heparine door negen delen bloed toe te voegen aan één deel K₃EDTA-natriumcitraat, of heparine volgens de instructies van de fabrikant. De volgende stappen worden in deze procedure beschreven.
Scheid en verwijder het plasma en de monocyten. Scheid en verzamel een neutrofielenlaag door rode bloedcellen te lyseren en breng de neutrofielen eerst in suspensie voor de eerste scheiding. Verzamel de neutrofielen in de NIM-laag.
Verzamel vijf milliliter isolatiemedium in een centrifugebuis. Door het isolatiemedium onderin de buis te plaatsen, kan het als filter fungeren, aangezien de centrifuge het bloed er voorzichtig doorheen zal drijven. Laag vijf milliliter bloed bovenop het NIM voor een schone scheiding.
Wees zeer voorzichtig om te voorkomen dat de oplossingen zich mengen. Voer deze stap langzaam en zorgvuldig uit, met de pipetpunt dicht bij het oppervlak van het scheidingsmedium om menging te voorkomen. Centrifugeer de oplossing bij 500 RCF gedurende 35 minuten.
Bij 20 tot 25 graden Celsius moet het bloed gescheiden worden in zes duidelijke banden. De zes banden zijn plasma, monocyten, isolatiemedium, neutrofielen, opnieuw isolatiemedium en het pellet van rode bloedcellen onderaan. Als deze zes banden niet helder en onderscheidend zijn, was het scheidingsproces niet zuiver en moet dit worden herhaald.
Veelvoorkomende oorzaken van een slechte scheiding zijn verouderde isolatiemedia, het gebruik van alcohol door de donor in de afgelopen 72 uur of het gebruik van andere medicijnen door de donor, zoals Tylenol of aspirine. Verwijder en gooi de plasma-monocyten en het isolatiemedium voorzichtig weg. Plaats deze lagen in een afsluitbare buis en gooi deze voorzichtig weg; pipetteer vervolgens de laag neutrofielen en al het isolatiemedium onder de neutrofielen in een schone centrifugeebuis om zoveel mogelijk neutrofielen te herstellen.
Het is vaak het eenvoudigst om ook een deel van het isolatiemedium uit de onderliggende laag mee te nemen. Verstoor het pellet aan de bodem niet. Tweede declaratie, verfijn de neutrofielenlaag.
Verdun de neutrofielensolutie tot 10 milliliter met HBSS zonder calcium. Keer de buis een paar keer om om de cellen te suspenderen en centrifugeer de neutrofielensolutie.
350 RCF gedurende 10 minuten. Bij 20 tot 25 graden Celsius moet er een rode pellet zichtbaar zijn op de bodem van de buis, bestaande uit neutrofielen en resterende rode bloedcellen. Verwijder het supernatant met de pipet.
Wees voorzichtig om het pellet onderin niet te verstoren bij het lyseren van de rode bloedcellen.
De rode bloedcellen in het monster moeten nu door lyse worden vernietigd. Voeg om de resterende rode bloedcellen te lyseren twee milliliter rode bloedcel-lysebuffer toe aan de buis om deze opnieuw te suspenderen. Suspendeer het pellet door de vial te vortexen op een stand van drie tot vier.
Vermijd het verhogen van de vortexinstelling boven vier, aangezien dit kan leiden tot activatie van de neutrofielen. Het kan nodig zijn om enkele seconden te vortexen of de vortex in pulsen te gebruiken om het pellet op te lossen. Centrifugeer de lysisoplossing bij 250 RCF gedurende vijf minuten.
Gebruik de optie 'soft start' om schade aan het monster te minimaliseren. Verwijder het supernatant met een pipette. Herhaal het lyseringsproces.
Indien nodig, voeg voor het resuspenderen van de neutrofielen 500 µL HBSS zonder calcium toe aan elke buis. Vortex de pellet op een stand van drie tot vier, verdun tot 10 mL met HBSS zonder calcium en centrifugeer. Centrifugeer de neutrofielen bij 250 RCF gedurende vijf minuten, aspireer het supernatant en gooi dit weg.
Resuspendeer de pellet in 250 µL HBSS met HSA-oplossing; er worden gewoonlijk 2 × 10⁶ neutrofielen per milliliter verzameld.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het isoleren van menselijke neutrofielen uit volbloed met behulp van een standaard densiteitsgradiëntscheidingstechniek. Neutrofielen spelen een cruciale rol in de inflammatoire immuunrespons, en het begrijpen van hun isolatie is essentieel voor verder onderzoek.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Immunologie
- Celbiologie
- Neurowetenschappen
Achtergrond
- Neutrofielen behoren tot de eerste respondenten bij ontstekingsreacties.
- Hun functies en mechanismen zijn uitgebreid in vitro bestudeerd.
- Isolatietechnieken zijn essentieel voor het bestuderen van het gedrag en de functies van neutrofielen.
- Gestandaardiseerde methoden verbeteren de reproduceerbaarheid in onderzoek.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode aan te tonen voor het isoleren van neutrofielen uit menselijk bloed.
- Om verder onderzoek naar de functies van neutrofielen bij ontstekingen te faciliteren.
- Om een protocol te bieden dat eenvoudig kan worden overgenomen in laboratoria.
Gebruikte methoden
- Methode voor scheiding via dichtheidsgradiënt.
- Gebruik van commercieel beschikbare scheidingsmedia.
- De benodigde apparatuur omvat een centrifuge en vials.
- Bereiding van oplossingen met HBSS met calciumchloride en humaan serumalbumine.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van neutrofielen uit volbloedmonsters.
- Demonstratie van de effectiviteit van de scheidingsmethode.
- Het bieden van een duidelijk protocol voor onderzoekers.
- Potentiële toepassingen bij het bestuderen van het gedrag van neutrofielen onder diverse omstandigheden.
Conclusies
- De gepresenteerde methode is effectief voor de isolatie van neutrofielen.
- Dit protocol kan onderzoek naar immuunrespons verbeteren.
- Verdere studies kunnen voortbouwen op deze isolatietechniek.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Betrouwbare isolatie van neutrofielen vormt de basis voor onderzoek naar immunologie en inflammatie in een vroeg stadium, wat nauwkeurige functionele studies en mechanistische risicoreductie bij geneesmiddelenontwikkeling mogelijk maakt. Neutrofielpreparaten met een hoge zuiverheid en viabiliteit ondersteunen een robuuste targetvalidatie en de ontwikkeling van kwantitatieve assays, wat een directe invloed heeft op het voorspellend vertrouwen bij cruciale beslismomenten in de portfolio. Gestandaardiseerde isolatieprotocollen bevorderen de reproduceerbaarheid en cross-functionele dataintegratie tussen discovery- en translationele teams.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt onderzoek mogelijk naar neutrofiel-specifieke pathways en immuunmechanismen die relevant zijn voor inflammatie en oncologie.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door het leveren van zuivere, levensvatbare neutrofielpopulaties voor downstream assays.
- Vermindert biologische ambiguïteit, waardoor het voorspellend vertrouwen bij hypothesetesten in vroege stadia wordt versterkt.
Screening & assayontwikkeling
- Levert gestandaardiseerde neutrofielmonsters met een hoge levensvatbaarheid voor reproduceerbare in vitro assays.
- Faciliteert de kwantitatieve meting van neutrofiele functies, zoals fagocytose en cytokinproductie.
- Maakt schaalbaarheid van assays en hergebruik van platformen mogelijk voor compound screening en mechanistische studies.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Levert ziekterelevant cellulair materiaal voor het modelleren van inflammatoire responsen in preklinische systemen.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door cel functie en levensvatbaarheid te behouden.
- Sluit aan bij translationele biomarkerstrategieën door functionele read-outs in menselijke immuuncellen mogelijk te maken.
Integratie van Pijplijn & Workflow
Dit protocol voor de isolatie van neutrofielen via een dichtheidsgradiënt vormt de schakel tussen vroege ontdekking en assay-ontwikkeling en ondersteunt workflows van targetvalidatie tot preklinisch onderzoek.
- Ontdekkingsbiologie: Levert zuivere neutrofielen voor hypothese-gestuurde functionele studies en pathway-analyse.
- Screening: Biedt reproduceerbare, kwantitatieve celgebaseerde assay-inputs voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytica: Maakt meting van celviabiliteit, zuiverheid en functionele outputs mogelijk voor comparatieve analyse.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en preklinische modellen met behulp van primaire menselijke immuuncellen.
- Bedrijfsbrede hergebruik: Stelt een gestandaardiseerd protocol vast dat aanpasbaar is voor meerdere onderzoeksprogramma's en ziektebeelden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische onzekerheid in studies naar immuuncellen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid, standaardisatie en schaalbaarheid van assays op basis van neutrofielen.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen en de kapitaalefficiëntie door het mogelijk maken van robuuste vroege gegevens.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van activa op het gebied van inflammatie en immunologie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist technische expertise in dichtheidsgradiëntscheiding en celbehandeling.
- Toegang tot centrifugatieapparatuur, steriele reagentia en gevalideerde scheidingsmedia is noodzakelijk.
- Strikte naleving van timing en temperatuurcontroles is vereist om de levensvatbaarheid van de cellen te behouden.
- Standaardisatie tussen teams is noodzakelijk voor reproduceerbare resultaten over verschillende studies heen.
- Beperkt door donorvariabiliteit en de korte levensduur van neutrofielen, wat snel gebruik in vervolgstappen vereist.
Veelgestelde vragen over biopharma
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:08
Equipment
0:24
Materials
1:24
Preparation of HBSS/HSA
2:06
Blood sample
2:38
Stages of neutrophil isolation
2:53
First separation: acquire neutrophils
4:56
Second separation: refine neutrophil layer
5:39
Third separation: lysing the red blood cells
6:27
Fourth separation: resuspending the neutrophils
