Trypsinizing en Steekenting zoogdiercellen

Weefselkweektechnologie heeft een brede toepassing gevonden in het veld van de celbiologie. Echter vereisen gekweekte cellen regelmatig onderhoud om gezond te blijven. Wanneer cellen confluentie bereiken, moeten ze worden gesubcultured of gepassaged.

Het nalaten hiervan resulteert in een verminderde groei en uiteindelijk in celdood. In deze video demonstreren we hoe we weefselkweekcellen kunnen onderhouden voor zowel adherente als suspensie-cellijnen. Hallo, ik ben Ricky van het laboratorium van Dr. LAN bij het Molecular Pathology Laboratories Network in Oost-Tennessee.

Vandaag wil ik u twee technieken laten zien voor het passeren van suspensie- en adherente cellen. Om een plaat met cellen te passeren, beginnen we met een primaire cultuur die tot confluentie is gegroeid in een Petri-schaal van 60 millimeter of een tissue culture-fles van 25 centimeter kwadraat die vijf ml weefselkweekmedium bevat.

We beginnen met het verwijderen van al het medium uit de primaire cultuur met de steriele pipet. Vervolgens wassen we de aanhechtende cellaag één of twee keer met een klein volume HBSS zonder calcium en magnesium bij 37 °C. Dit is om eventueel resterend foetaal runderserum te verwijderen dat de werking van het trypsine-enzym, dat in de volgende stap wordt toegevoegd, kan remmen.

Voeg vervolgens voldoende warme trypsin-EDTA-oplossing toe aan de kweek zodat de adherente cellaag bedekt is. Daarna kunt u de plaat gedurende één tot twee minuten op een warmteplaat van 37 °C plaatsen. Tik na de incubatie tegen de bodem van de plaat op een vlak oppervlak om de cellen los te maken.

Controleer de cultuur met een omgekeerde microscoop om er zeker van te zijn dat de cellen zijn afgerond, wat aangeeft dat ze zijn losgekomen van het oppervlak. Als de cellen onvoldoende zijn losgekomen, plaats de plaat dan nog een minuut of twee terug in de verwarmingsbak. Spoel na inspectie onder de microscoop de schaal met compleet medium en pipetteer de suspensie in een 15 mil conische buis die twee mils compleet medium bevat.

Centrifugeer de cellen om een pellet te vormen en resuspendeer de pellet in compleet medium. Voeg vervolgens een gelijk volume cel-suspensie toe aan elke van de vers voorbereide en correct gelabelde platen. Alternatief kunnen de cellen worden geteld met een hemocytometer en worden verdund tot de gewenste dichtheid, zodat een specifiek aantal cellen aan elke plaat kan worden toegevoegd.

Zorg ervoor dat elke plaat wordt gelabeld met de datum van de subcultuur en het passagenummer. Voeg na het toevoegen van de celsuspensie 1 ml vers medium toe aan elke nieuwe cultuur. Incubeer de platen vervolgens in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2.

Nadat u de cellen een nacht heeft geïncubeerd, voegt u vers medium toe aan de platen en plaatst u deze terug bij 37 graden. Zodra de plaat confluent is, kunt u de plaat opnieuw passageren door deze procedure te herhalen en indien nodig verder passageren. Nu laten we u zien hoe u cellen in suspensiecultuur passageert.

Het verpakken van cellen in suspensiecultuur is eenvoudiger dan voor adherentiecellen. Voordat suspensieculturen worden verpakt, moeten de cellen in stand worden gehouden door elke twee tot drie dagen voeding toe te voegen totdat ze confluentie bereiken; dit is het moment waarop de cellen in de suspensie samenklonteren en het medium troebel oogt wanneer de kolf wordt rondgedraaid.

Om dit te doen, haalt u de kolf met suspensiecellen uit de incubator, waarbij u er zorg voor draagt dat de cellen die naar de bodem van de kolf zijn gezakt niet worden verstoord. Verwijder aseptisch ongeveer een derde van het medium uit de kolf en vervang dit door een gelijk volume voorverwarmd medium bij 37 °C. Nadat u het medium heeft vervangen, draait u de kolf voorzichtig rond en plaatst u deze terug in de incubator bij 37 °C en 5% CO2.

Als er minder dan 15 ml medium in de kolf aanwezig is, dient de kolf in een horizontale positie te worden geïncubeerd om het contact tussen de cellen en het medium te verbeteren. In overige gevallen kan de kolf verticaal worden geïncubeerd op de dagen dat de culturen niet worden gevoed. Controleer deze door de kolven te zwenken om de cellen te resuspenderen.

Let goed op eventuele kleurveranderingen in het medium die duiden op een goede metabole groei. Zodra de culturen confluent zijn, wat ongeveer 2,5 miljoen cellen per ml moet zijn, kunnen ze worden gesubcultiveerd. Hiermee hebben we aangetoond hoe u gecultiveerde cellen kunt passageren voor zowel adherente als suspensieculturen.

Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met al uw experimenten.