Kleuring Eiwitten in Gels

In een eerdere video met de titel Electrophoretic Separation of Proteins hebben we gedemonstreerd hoe een complex mengsel van eiwitten kon worden gescheiden met behulp van gelelektroforese. In deze video laten we u vier verschillende gelkleuringsmethoden zien om de locatie van de eiwitten in de gel te visualiseren. Hallo, ik ben Sean Gallagher van UVP en ik werk samen met het Proteomics Center hier aan het KEG Graduate Institute.

Vandaag laat ik u een aantal technieken zien voor het visualiseren van eiwitten na scheiding door middel van elektroforese. Dit omvat Coomassie blue, zilverkleuring, cyro orange en cyro ruby. Laten we beginnen met Coomassie blue.

De detectie van proteïnebanden in een gel door Coomassie-blauw kleuring is afhankelijk van de aspecifieke binding van een kleurstof. In dit geval Coomassie brilliant blue G-250. Bij deze methode worden proteïnen die gescheiden zijn in een polyacrylamidegel gewassen met water van hoge zuiverheid.

De locatie van de eiwitten wordt vervolgens gedetecteerd met een op water gebaseerde kamasi blue-kleuring. De detectielimiet bedraagt 0,3 tot 1 µg per eiwitband. Begin met een polyacrylamidegel waarin de eiwitten via elektroforese zijn gescheiden.

Plaats de polyacrylamidegel bij langzaam roeren in een plastic bak gevuld met 300 milliliters ultrapure water. Laat dit vijf minuten inwerken. Gooi het water weg en herhaal dit nog twee keer na de derde wasbeurt.

Giet het water af en bedek de gel gedurende één uur met Coomassie blue kleuringsoplossing onder langzame agitatie. Giet na één uur kleuren de kleuringsoplossing af. Spoel de gel kort door deze gedurende 30 minuten in ongeveer 200 milliliters water te plaatsen. Op dit punt kan de gel in water worden bewaard voor toekomstige beeldvorming.

De gel kan in dit stadium ook worden gedroogd om een permanent gelrecord te behouden. Plaats hiervoor de gel op twee vellen Watman filterpapier van drie mm en bedek de bovenkant met plasticfolie. Droog de gel vervolgens in een conventionele geldroger gedurende één tot twee uur bij ongeveer 80 °C.

Een andere methode voor eiwitkleuring is zilverkleuring, die we nu zullen demonstreren. Hoewel de Coomassie-blauw-kleuringsmethode eenvoudiger en sneller is, is zilverkleuring aanzienlijk gevoeliger met een detectielimiet van 0,3 nanogram BSA. De detectie van eiwitbanden in een gel via zilverkleuring is afhankelijk van de binding van zilver aan verschillende chemische groepen in het eiwit.

Het volgende protocol is gebaseerd op de Silver Quest zilverkleuringskit van Invitrogen. Het protocol is afgeleid van het snelle kleuringsprotocol van ongeveer 30 minuten en is een van de vele kit-gebaseerde chemieën voor zilverkleuring die compatibel zijn met massaspectrometrie. In dit geval gebruiken we een Invitrogen precast mini-gel voordat we beginnen met de zilverkleuring.

Draag te allen tijde handschoenen om contaminatie door vingerafdrukken te voorkomen. Plaats de gel in een magnetronbestendige schaal met 100 milliliters water van reagentiekwaliteit. Spoel kort na en giet het water vervolgens af.

Voeg vervolgens 100 milliliter fixeerder toe, bestaande uit 40% ethanol en 10% azijnzuur in hoogzuiver water, en verhit dit 30 seconden in de magnetron. Het magnetronproces verkort de benodigde incubatiestappen door de binding en kleuring te versnellen. Plaats de gel op dit punt op een schudapparaat en schud deze vijf minuten lang langzaam.

Giet na vijf minuten het fixeerder af, voeg 100 milliliters 30% ethanol toe om de gel te wassen, verhit deze 30 seconden in de magnetron en plaats de gel vervolgens vijf minuten op een schudapparaat. Giet na vijf minuten de ethanol af. Voeg nu 100 milliliters sensibiliseringsreagens toe, verhit dit 30 seconden in de magnetron en plaats het vervolgens twee minuten op een schudapparaat.

Giet na twee minuten het sensibiliseringsreagens af. Voeg 100 milliliters water van reagenskwaliteit toe, verhit dit 30 seconden in de magnetron en plaats het twee minuten op een schudmachine. Giet af en herhaal dit voor in totaal twee wascycli.

Voeg nu 100 milliliters kleuringsoplossing toe, verwarm 30 seconden in de magnetron en agiteer langzaam gedurende vijf minuten. Giet na deze vijf minuten de kleuringsoplossing af. Voeg 100 milliliters water van reagentiekwaliteit toe, sla de stap met de magnetron over en plaats het monster direct op een schudmachine voor 20 tot 60 seconden.

Giet het water weg en voeg onmiddellijk 100 milliliters van de ontwikkelaar toe en ontwikkel tot de eiwitbanden zichtbaar worden. Terwijl de achtergrond helder blijft, zal dit ongeveer vijf tot 10 minuten duren. Voeg op dit punt 10 milliliters stopoplossing toe aan de ontwikkelaar om de ontwikkeling te stoppen voor het beste resultaat.

Fotografeer de gel zo snel mogelijk, aangezien er lichte veranderingen in kleurintensiteit en een toename van niet-specifieke achtergrondelementen kunnen optreden. Na verloop van tijd bevat de gel die u ziet residuele eiwitten. Droog de gel na elektroblotting om een permanent verslag te bewaren of bewaar deze in een afsluitbare plastic zak. Vervolgens demonstreren wij een methode voor het fluorescentiekleuren van gels.

Fluorescerende kleurstoffen hebben een aantal voordelen ten opzichte van traditionele eiwitkleuringen. Cipro orange eiwitgelkleuringen, die we hier zullen beschrijven, kunnen één tot twee nanogram eiwit per band detecteren. Dit is gevoeliger dan Coomassie brilliant blue-kleuring en even gevoelig als veel zilverkleuringstechnieken.

Fluorescerende kleuring is eenvoudig, vereist minder handmatige tijd dan typische zilverkleuringsprotocollen en is binnen een uur voltooid. Gekleurde eiwitten kunnen worden gevisualiseerd met een standaard 300 nanometer UV-transilluminator of een laserscanner. In dit geval zullen we opnieuw een Invitrogen precast mini gel gebruiken om eiwitten voor te bereiden en te scheiden middels SDS-PAGE.

Gebruik echter 0,05% SDS in de loopbuffer in plaats van de gebruikelijke 0,1% SDS om de achtergrondfluorescentie te verminderen. Giet, om te beginnen met de kleuringsprocedure, de cipro oranje fluorescente kleuringsoplossing in een klein plastic bakje voor één of twee standaardformaat minigels. Gebruik ongeveer 50 milliliters kleuringsoplossing.

Het is belangrijk om op te merken dat kleurplaten vóór gebruik grondig gereinigd en gespoeld moeten worden, aangezien detergentia de kleuring kunnen beïnvloeden. Plaats nu de gel in de kleuringsoplossing. Dek de houder af met aluminiumfolie om de kleurstof tegen fel licht te beschermen.

Schud de gel voorzichtig gedurende 40 tot 60 minuten bij kamertemperatuur. Gooi de kleuringsoplossing weg en spoel de gel vervolgens minder dan een minuut met ongeveer 100 milliliters 7,5% azijnzuur om overtollige kleurstof van het geloppervlak te verwijderen; ontkleur de gel door deze overnacht te incuberen in 0,1% tween 20 om de proteïnebanden te visualiseren en te fotograferen. Plaats de fluorescentielabelgel direct op een standaard 300 nanometer transilluminator of een blauwe licht-transilluminator.

Vervolgens demonstreren we een alternatieve fluorescente kleuringsmethode, waarbij Cipro ruby fluorescente kleurstof wordt gebruikt. De Cipro ruby kleuringsmethode is specifiek ontworpen voor gebruik in tweedimensionale PAGE, maar is gebleken de meest gevoelige eiwitgelkleuring te zijn voor standaard eendimensionale SDS-PAGE. Begin met het overbrengen van de gel naar een schone polypropyleen of PVC schaal van passende grootte.

Incubeer de gel in de juiste hoeveelheid onverdunde cipro ruby eiwitgelkleurstof onder voortdurende zachte agitatie op een orbitale schudmachine bij 50 RPMs. Dek de gel af en incubeer deze gedurende ten minste drie uur. Verplaats de gel naar een schone kleuringsschaal, was deze eenmaal in een oplossing van 10% methanol en 7% azijnzuur, herstel de vloeistof en plaats de gel gedurende 30 minuten terug op de rocker.

Om de achtergrondfluorescentie te verminderen en de gevoeligheid te verhogen, is de gel nu klaar om te worden bekeken en gefotografeerd. Hartelijk dank voor het bekijken van de protocollen van vandaag. We hebben u verschillende procedures laten zien voor het visualiseren van eiwitten na elektroforese.

Sommige zijn zeer gevoelig, zoals fluorescente kleuring en zilverkleuring, en andere zijn routinematig, zoals kamasi-blauwkleuring. Het is belangrijk om te onthouden dat de zuiverheid van de reagentia cruciaal is. Het gebruik van ultrapuur water is ook zeer belangrijk, evenals de timing van elke stap.

U dient hier nauwgezet op te letten om ook reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Dat is alles en veel succes met uw volgende reeks experimenten.