Interview: bioreactoren en ondergedompeld-Modified 3D-Stellingen voor stamcelonderzoek

Mijn naam is Karlan en ik werk als biofysicus bij het Institute for Biological Interfaces. Aan het Cal Screw Institute of Technology ontwikkelen we bioreactoren en oppervlakte-gemodificeerde driedimensionale steigers voor de kweek van functionele weefsels en voor stamcelonderzoek; we zijn voornamelijk geïnteresseerd in de interactie van cellen met hun kunstmatige omgeving. Een Nature-artikel uit 2003 stelde de vraag over platte biologie, en de vraag is: wat wordt hieronder verstaan?

In het verleden kampten veel in vitro cultuursystemen, voornamelijk monolaagculturen, met nadelen zoals dat gedifferentieerde primaire cellen een relatief korte levensduur hadden en tijdens de cultuur dedifferentieerden. Dit betekent dat ze het merendeel van hun organspecifieke functies zeer snel verloren. Daarom zijn er in conventionele monolaagculturen veel verschillende modificaties en aanpassingen doorgevoerd om betere in vitro condities voor deze cellen te reproduceren.

En dit omvat de samenstelling van het kweekmedium en het aanbrengen van een coating op kweekvaten waarin de cellen hoofdzakelijk monolagen vormen. Al deze benaderingen wijzen op het belang van interacties tussen cellen en de matrix, evenals cel-celcommunicatie. Een ander belangrijk aspect lijkt het tot stand brengen van celspecifieke contexten te zijn, die bijvoorbeeld worden gerealiseerd door gap junction-complexen, een veelvoorkomend kenmerk van veel cellen in vivo.

In conventionele monolayer-culturen gaat de communicatie via gap junctions snel verloren. Gedurende lange tijd was het mogelijk om in vitro tot op zekere hoogte een weefselachtige rangschikking van cellen te herstellen met behulp van de zogenaamde steroïdtechniek.

Een voorbeeld uit ons laboratorium was dat we konden aantonen dat zelfs volwassen ru hepatocyten in staat zijn om steroïden te vormen en gedurende ten minste weken levensvatbaar blijven in deze aggregaten. Hepatocyten blijven in nauw contact met elkaar, wat de cellulaire communicatie bevordert en resulteert in de stabilisatie van hepatocyt-specifieke functies. We stelden echter ook vast dat deze conventionele driedimensionale kweektechniek verschillende nadelen heeft.

De aggregaatgrootte is cruciaal. Bij grote aggregaatdiameters kan necrose ontstaan, en in de meeste gevallen is de ratio tussen mediumvolume en aantal cellen onjuist. Daarnaast kunnen schuifkrachten en spinnerculturen problematisch zijn.

Organen en weefsels in levende organismen worden onder andere gekenmerkt door zeer hoge celdichtheden; daarnaast is het gericht actief transport van stoffen door deze weefsellagen een belangrijke eigenschap. Daarom zouden realistische organotypische in vitro weefselmodellen deze natuurlijke architectuur zo nauwkeurig mogelijk moeten nabootsen. Een essentiële bepalende factor voor de beperking van dergelijke systemen is de juiste verhouding tussen mediumvolume en celvolume.

Zoals eerder vermeld, hebben we een geschikte celbehuizing ontworpen in de vorm van een nauwkeurig gestructureerd polymeersteunraamwerk, dat gelijkmatige containers biedt voor de driedimensionale kweek van celaggregaten. Voor het polymeersteunraamwerk gebruiken we bij voorkeur PMMA of PC polyether of polycarbonaat. Dit bestaat uit een gestructureerd plat apparaat van één vierkante centimeter, dat een dichte reeks van meer dan 1000 van deze containers biedt.

Voor de driedimensionale kweek van celaggregaten is aangetoond dat dit geschikt is voor 3D-celkweek gedurende meerdere weken. Elk van deze kleine kubusvormige containers in de array heeft een zijlengte van ongeveer 300 Micrometers. Het speciale ontwerp van dit steunstructuur en van de periferie, oftewel de incubatiekamer.

Het medium- en gasvoorzieningssysteem van de ector maakt verschillende modi van mediumtoevoer mogelijk. Ten eerste superfusie, waarbij beide zijden van het weefsel afzonderlijk worden voorzien van voedingsmedium, en ten tweede perfusie.

Dit betekent dat de mediumstroom gedwongen wordt om door de weefsellaag te dringen. De perfusiemodus kan worden gebruikt om condities te creëren die de in vivo vascularisatie beter nabootsen, maar een gemengde modus van perfusie en superfusie is ook mogelijk. Er zijn verschillende generaties cell chips ontwikkeld.

Elke generatie kan met een specifiek ontwerp worden gebruikt om te voldoen aan de behoeften van elke speciale toepassing. Zo zijn er ontwerpen gebouwd voor enkelvoudige en dubbele chip-bioreactoren, evenals afzonderlijk adresseerbare multi-titer arrangementen of sterk geparallelliseerde varianten. Als opgeschaalde versies voor de laatste generatie van deze verschillende vormen is er een bepaalde technologie ontwikkeld voor de zogenaamde micro-thermovormcontainers; hiermee is het mogelijk om het gehele oppervlak van deze 3D-gevormde containers te modificeren, waarbij zelfs oppervlakte-patterning op submicron-schaal met signaleringsmoleculen mogelijk is.

Daarnaast kunnen sensoren en signaalelektroden worden geïntegreerd. De toepassingen variëren van fundamenteel onderzoek en celbiologie tot toxicologie en farmacologie, waarbij ook high-throughput screening mogelijk is. Een zeer belangrijk punt tot slot is het feit dat de laatste generatie van onze micro-thermoformchips is geoptimaliseerd om processen voor goedkope massaproductie mogelijk te maken en daardoor geschikt te zijn voor toepassing in andere laboratoria.