Generatie van Stable transgene C. elegans Met behulp van micro-injectie

Sea elegance is een ongelooflijk nuttig modelorganisme dankzij zowel onze kennis van de cellijnen als de overvloed aan informatie die is voortgekomen uit het sequenceren en analyseren van het volledige genoom. In deze video demonstreren we het proces van micro-injectie van plasmiden in sea elegance en de selectie van transgene nakomelingen met behulp van fluorescentiemicroscopie; als transparant en meercellig dier is sea elegance ideaal voor het in vivo visualiseren van transgenen die fluorescent gelabelde eiwitten tot expressie brengen. Hallo, mijn naam is Laura Berkowitz en ik ben research associate in het Caldwell Lab van de afdeling Biological Sciences hier aan de University of Alabama.

En ik ben Adam Knight, ook van het Calwell Lab aan de University of Alabama. Vandaag laat ik u zien hoe u zich voorbereidt op en het uitvoeren van plasmidmicro-injectie om transgene C. elegans te genereren, en ik zal u laten zien hoe u transgene C. elegans-lijnen selecteert en onderhoudt. Laten we beginnen.

Voordat we beginnen met de micro-injectie, zijn er enkele voorbereidingsstappen die ik u nu zal tonen. Bereid eerst het plasmid-DNA voor dat geïnjecteerd moet worden; er zijn twee plasmiden nodig, één dat de weefselspecifieke expressie van ons gen van belang codeert, en een tweede dat een selecteerbare transformatiemarker biedt. Meng de plasmiden in een verhouding van één-op-één met een concentratie van 50 nanogram per µL.

Bereid vervolgens de boorplaten voor, die worden gebruikt om de wormen te immobiliseren voor injectie. Om de boorplaten te maken, legt u eerst enkele dekglasplaatjes van 22 bij 50 millimeter op de werkbank. Plaats met een Pasteurpipet een druppel gesmolten 2% agros op één dekglasplaatje en plaats onmiddellijk een tweede dekglasplaatje in een hoek van 90 graden ten opzichte van het eerste over de druppel.

Laat de aerogel enkele seconden uitharden en verwijder vervolgens het bovenste dekglas. De diameter van de afgeplatte schijf aerogel moet tussen de 15 en 20 millimeter liggen. Laat het kussen, zoals bij een Petri-schaal, gedurende enkele uren of een nacht volledig aan de lucht drogen.

Zodra ze droog zijn, bewaart u de pads in een decentratiedoos bij kamertemperatuur. Bereid vervolgens de naaldladers voor de DNA-oplossing voor. Doe dit door een capillaire buis van honderd microliter te nemen, deze in het midden in een open vlam te verhitten en vervolgens snel uit te trekken tot ongeveer twee keer de oorspronkelijke lengte.

Zodra de capillaire buis is afgekoeld, breekt u de twee helften uit elkaar. Bereid 10 tot 20 naaldladers voor voor de injectie. U kunt deze rechtop bewaren in een microcentrifugebuis.

Brack, wees voorzichtig. De punten van de naaldlader zijn zeer scherp. Maak nu de micro-injectienaalden.

Deze naalden zijn gemaakt van een speciale capillaire buis die een intern glasfilament bevat. Dit filament dient als pit voor de DNA-oplossing. Om de naalden te maken, gebruiken we een Niki PP eight 30 Polar met een warmteinstelling van 24,8; er worden meerdere naalden tegelijkertijd getrokken voor opslag.

Meerdere naalden kunnen op een strip boetseerklei worden gemonteerd. Kleine scherven dekglas zullen worden gebruikt om de uitgetrokken naaldpunt open te breken. Deze scherven worden bereid door een dekglas van 18 bij 18 millimeter in een Kim wipe te wikkelen en voorzichtig druk uit te oefenen totdat het in verschillende stukken breekt.

Gebruik scherven met een afmeting van ongeveer drie bij vier millimeter. Bereid naast het DNA en de naalden ongeveer 50 tot 100 wormen voor in het juiste stadium. Gebruik twee wild-type wormen voor elk expressievectorconstruct dat geïnjecteerd zal worden.

We zijn nu klaar om de micro-injectiemicroscoop op te stellen. Om met de installatie van de microscoop te beginnen, opent u de hoofdkraan van de heliumtank die is verbonden met de arm en houder van de micro-injectienaald. Sluit de regulator om het gas in de leiding te laten stromen.

Nadat de druk op 35 PSI is gebracht, kan het gas met een voetpedaal worden losgelaten. Plaats vervolgens een naaldlader in de slang van een standaard mondpipetteur en breng een kleine hoeveelheid van het plasmide-mengsel over, ongeveer één microliter. Schuif de lader nu voorzichtig geheel door de micro-injectienaald tot er weerstand wordt gevoeld.

Druk de DNA-oplossing voorzichtig naar buiten door te blazen en verwijder vervolgens de loader. Zodra het DNA is geladen, plaatst u de naald in de micro-injectiearm, waarbij u erop let dat deze in de kleine interne rubberen afdichting wordt geplaatst, en klem deze vervolgens vast aan de arm van de manipulator. Plaats daarna een splinter dekglas om de naald te breken op één rand van een auger-pad.

Bedek de splinter alsovolg als het gehele oppervlak van het auger-plaatje met hallow carbon-olie. Plaats vervolgens het auger-plaatje op de tafel van een omgekeerde microscoop. Nadat het auger-plaatje is geplaatst, wordt de naald in het centrum van het gezichtsveld gepositioneerd met behulp van het Forex-objectief en helderveldverlichting, maar laat deze nog niet in de olie zakken.

Plaats vervolgens de binnenrand van het dekglasfragment in het midden en stel hierop scherp. Laat de naald in de olie zakken, zodat deze zich in hetzelfde brandvlak als het dekglasfragment bevindt. Verhoog de vergroting door over te schakelen naar het 40 x objectief, stel vervolgens opnieuw scherp op de rand van het fragment en positioneer de punt van de naald indien nodig opnieuw.

Breek nu de punt van de injectienaald open. Duw de naald voorzichtig tegen de rand van het scherfje dekglas, terwijl u tegelijkertijd een korte gaspuls via het voetpedaal geeft. De naald zal zo voldoende worden opengebroken.

Wanneer kleine druppels vloeistof uit het uiteinde van de naald ontsnappen door een te grote vloeistofstroom, is dit ongewenst omdat dit de dieren zal doden. Zodra de naald gereed is, beginnen we met de micro-injectie. Verwijder vervolgens het auger-kussen van de tafel door de naald omhoog te bewegen.

Wijzig echter niet de positie van de X- of Y-as. Schuif de tafel onder de naald vandaan. Verwijder het boorplaatje en plaats dit onder een dissectiemicroscoop.

Verplaats een worm naar het kussentje onder het olieoppervlak. Als de worm writelt, strijk deze dan voorzichtig aan tot hij het boorkussentje raakt; de vochtige worm zou aan het droge boorkussentje moeten hechten. Plaats het boorkussentje snel terug op de tafel, waarbij de worm in het midden van het gezichtsveld wordt gecentreerd.

Breng de naald vervolgens naar hetzelfde focusvlak als de worm. Schakel de filters op de omgekeerde microscoop over naar Hoffman-verlichting. Dit contrastfilter zorgt ervoor dat morfologische details van de worm zichtbaar worden.

Focus met het 40 x objectief op het korrelige sensorische centrum van de gonade van de worm, onder het honingraatpatroon van de kiemkernen. Kies de gonade die zich aan de zijde van de worm bevindt die naar de naald is gericht. Stel de positie van de naald nauwkeurig af totdat de punt ook in focus is.

Voer de naald voorzichtig in het centrum van de gonade in en breng een korte puls gasdruk toe om één of twee druppels DNA in de gonadearm te injecteren. Met voldoende oefening en vaardigheid zou u een golf van vloeistof over de distale gonade zien verspreiden. U kunt hiermee telkens het centrum van de gonade raken.

Houd er rekening mee dat het belangrijk is om snel te werken tijdens het injecteren van een worm, aangezien deze gemakkelijk kan uitdrogen. Het gehele proces zou idealiter minder dan één tot twee minuten moeten duren.

Zodra de injectie is voltooid, verwijdert u het auger-kussen van de tafel en plaatst u dit onder een dissectiemicroscoop. Breng één µL M9-buffer direct aan op de geïnjecteerde worm. Dit kan betekenen dat de pipetpunt onder het oppervlak van de halo carb-olie moet worden ondergedompeld.

De buffer moet de worm rehydrateren, waardoor deze van het oppervlak van het aeros-pad zal own drijven; verplaats de worm vervolgens met een worm-pick naar een reguliere plaat. Nu draag ik de geïnjecteerde wormen over aan Adam, die ons de selectie en het onderhoud van transgene lijnen zal tonen. De geïnjecteerde wormen worden overgebracht naar individuele, vers gezaaide platen van 60 millimeter en krijgen de gelegenheid om zich voort te planten.

Deze wormen vertegenwoordigen de P0-generatie. Meestal worden de geïnjecteerde dieren twee tot drie dagen geïncubeerd bij 20 °C totdat het nageslacht verschijnt. Zodra het nageslacht zichtbaar is, kunnen we beginnen met het screenen op transgene wormen.

De F1-nakomelingen worden geobserveerd op bewijs van de transgene marker. In dit geval is de selecteerbare marker fluorescent, waardoor we kunnen screenen met behulp van een fluorescent stereomicroscoop. Elk fluorescent dragend F1-dier wordt afzonderlijk gekloond op een nieuwe plaat.

De geïnjecteerde P0 kan mogelijk slechts één tot vijf fluorescerende nakomelingen produceren binnen de gehele F1-generatie. Laat de F1-hermafrodieten zich twee tot drie dagen lang voortplanten bij 20 °C totdat de nakomelingen verschijnen. Zodra de F2-generatie gereed is, worden ook zij geobserveerd op de aanwezigheid van transgene dieren. F2-dieren die een transgene marker hebben geërfd en tot expressie brengen, worden beschouwd als een stabiele lijn.

Elke onafhankelijke stabiele lijn moet als een aparte lijn wormen worden onderhouden; vermeerder elke lijn door bij elke generatie meerdere transgene dieren over te brengen naar een nieuwe plaat. Dit moet worden uitgevoerd met behulp van een fluorescente stereomicroscoop. Als de selecteerbare marker fluorescent is, genereer dan minimaal drie onafhankelijke stabiele lijnen per geïnjecteerd construct om te controleren voor de variabiliteit in het genkopiegetal.

We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u expressieve vectorconstructen micro-injecteert, deze visualiseert in elgan en selecteert op stabiele lijnen. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.