Screening op Amyloid Aggregation door semi-denaturerende Detergent-agarosegelelektroforese

Hallo, ik ben Randall Hoffman, promovendus in het laboratorium van Susan Linus van de afdeling biologie aan MIT. Vandaag introduceer ik u bij semi-denaturerende detergent-agarosegelelektroforese, of SDD-AGE. Ons laboratorium gebruikt deze techniek om te screenen op prionen en andere amyloïde eiwitten.

Onze versie van SDD-leeftijd is eenvoudig en betrouwbaar en kan worden geschaald om elk aantal monsters te accommoderen. Amyloïden zijn uitzonderlijk resistent tegen denaturatie door SDS, waardoor ze met behulp van SDDH kunnen worden gescheiden van andere eiwitten. Gegevens van SDDH kunnen echter op zichzelf niet worden gebruikt om te bevestigen dat iets een amyloïde is.

Om dat te doen, moet u andere technieken gebruiken. Met dat in gedachten, laat ik het u zien. S-D-D-H-S-D-D-H kan worden uitgevoerd met standaardapparatuur voor horizontale DNA-elektroforese.

Ten eerste moet u de gietbak voor de gel assembleren. De grootte van de apparatus hangt af van het aantal monsters dat u heeft. Voor een groot aantal monsters gebruiken we een plaat van 20 bij 24 centimeter en maximaal vier kammen met 50 putjes.

Om de gel voor te bereiden, heeft u een agarose met gemiddelde of hoge gelsterkte en een laag EEO-gehalte, een 1x TAE-buffer en een 10% stockoplossing van SDS nodig. Maak een 1,5% agarose-oplossing in 1x TAE. Maak de gel zo dik mogelijk, zodat u de maximale hoeveelheid monster kunt laden en de detectie kunt optimaliseren. Verwarm het mengsel in de magnetron tot de agarose volledig is opgelost.

Voeg de 100 XSDS-stamoplossing snel toe aan 0,1% en draai het mengsel rond om te mengen. Als er tijdens deze stap wat neerslag ontstaat, los dit dan op een warmteplaat op. Let erop dat het mengsel niet gaat koken.

Giet deze oplossing in de gietplaat terwijl deze nog heet is, aangezien de oplossing na toevoeging van SDS gemakkelijk kan overkoken. Gebruik vervolgens een kam om eventuele luchtbellen te verwijderen die later during de geltransfer hinderlijk kunnen zijn. Wanneer de gel volledig is afgekoeld en gestold, worden de kammen voorzichtig verwijderd en wordt de gel in het tankje geplaatst.

Dompel de gel volledig onder in één XTAE met 0,1% SDS. U kunt nu de monsters laden. De eiwitmonsters die worden gebruikt in SDDH worden op dezelfde manier voorbereid als bij een SDS-page, met twee belangrijke uitzonderingen.

Ten eerste dient u te voorkomen dat de monsters worden verhit, omdat dit de aggregaten kan denatureren tot eiwitmonomeren. Ten tweede moet u er zorg voor dragen dat eiwitdegradatie wordt voorkomen. Omdat de hier gebruikte denaturerende condities onvoldoende zijn om alle proteasen te inactiveren, raden wij aan om ten minste twee keer de aanbevolen concentratie van een complete protease-remmercocktail te gebruiken.

In deze demonstratie gebruiken we lysaten van gistcellen die een specifiek eiwit van belang overexpresseren. Over het algemeen gebruiken we twee ml overnight-culturen, gekweekt in 96-well blocks verkrijgbaar bij VWR, maar bij het analyseren van eiwitten met een lage abundantie moeten grotere cultuurvolumes worden gebruikt.

Oogst de cellen door de cultuur vijf minuten lang te centrifugeren bij 2000 RCF bij kamertemperatuur. Verwijder na centrifugering het supernatant en was de cellen door ze opnieuw te suspenderen in water en opnieuw te centrifugeren. Verwijder na de tweede spin het supernatant en resuspendeer de cellen in plating-oplossing. De enzymen in de oplossing verteren de celwanden, wat een efficiënte lyse van de cellen mogelijk maakt met een klein volume lysisbuffer. Incubeer gedurende 30 minuten bij 30 °C.

Centrifuge de resterende plastic cellen deze keer 5 minuten bij 800 RCF om een pellet te vormen. Verwijder het supernatant volledig en resuspendeer elke pellet in 100 µL lysisbuffer. Bedek vervolgens het blok met tape en vortex op hoge snelheid gedurende twee minuten.

Dit helpt om alle plastic bolletjes samen met het celdebris bij 4,000 RCF neer te slaan. Gedurende twee minuten. Breng het supernatant voorzichtig over naar een 96-wells PCR-plaat.

Meestal analyseren we in ons laboratorium honderden monsters tegelijk, waarvoor we gebruikmaken van een vloeistofbehandelingssysteem. Bepaal indien gewenst de eiwitconcentratie van de lysaten. Voeg vervolgens vier x monsterbuffer toe aan de monsters om lysaten te verkrijgen die één x monsterbuffer bevatten en incubeer deze gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Laad nu de monsters in de gel. Indien gewenst kunnen de helft van de monsters worden bewaard voor SDS-PAGE-analyse. Laad daarnaast molecuulgewichtmarkers, waaronder vooraf gekleurde markers en een marker met een zeer hoog molecuulgewicht, zoals kippenflector-extract.

Indien gewenst is het belangrijk om de gel koel te houden om diffusie van eiwitten met een laag molecuulgewicht te voorkomen, dus kunt u deze in de koelruimte laten lopen. Laat de gel lopen bij een laag voltage van minder dan drie volt per centimeter van de gellengte. Laat de gel enkele uren lopen totdat de kleurstof ongeveer één centimeter van het einde van de gel bereikt.

Omdat amyloïd bij kamertemperatuur niet wordt gedenatureerd door 2% SDS, blijft het intact terwijl andere complexen, waaronder de meeste niet-amyloïde aggregaten, dissociëren in de aanwezigheid van 2% SDS. Hierdoor zullen de meeste eiwitten monomeer zijn en snel door de gel migreren, terwijl de SDS-resistente amyloïden met een hoog molecuulgewicht langzamer migreren.

Daarna is de gel klaar voor overdracht. Hoewel meerdere overdrachtsmethoden kunnen worden gebruikt, behalen wij de beste resultaten met capillaire overdracht. Omdat capillaire overdracht geschikt is voor elke gelgrootte, is het praktisch om honderden monsters via capillaire overdracht te analyseren.

Een stapel droge blotpapieren dient om de buffer door de gel te trekken, waardoor eiwitten worden afgezet op een nitrocellulosemembraan dat tussen de papieren en de gel is geplaatst. U moet een stuk nitrocellulose, zoals high bond C, extra, knippen op dezelfde afmetingen als de gel. U moet daarnaast 20 stukken GBO 04 en acht stukken GBO 02 blotpapier knippen op dezelfde grootte als de gel.

GB 04 is zeer dik en absorberend. Terwijl GB 02 veel dunner is en een fijnere textuur heeft, wat zorgt voor een gelijkmatiger contact met het membraan. Snijd een extra stuk GB 04 om als lont te gebruiken en maak dit ongeveer 20 centimeter breder dan de ondergedompelde gel.

Combine de nitrocellulose UL WIC, vier stukken GBO O2 en één XTBS in een plastic bak en stel een stapel papier als volgt samen: 20 stukken droge GBO O4, vervolgens vier stukken droge GBO O2 en tot slot één stuk voorgewette GBO O2.

Leg de nitrocellulose bovenop deze stapel. Spoel de gel op de gietplaat kort af met water om overtollige loopbuffer te verwijderen. Begin vervolgens voorzichtig de gel van de plaat op de stapel te schuiven, terwijl u de gel bij anvoeging van TBS indien nodig van de plaat schuift.

De extra buffer helpt te voorkomen dat er luchtbellen in de gel opgesloten raken. De transferpipet is hiervoor zeer geschikt nadat de gel volledig naar de stack is verplaatst. Controleer grondig of er luchtbellen aanwezig zijn.

Til de rand van de gel op en voeg opnieuw buffer toe totdat de luchtbellen zijn verwijderd. Plaats de overige drie voorbevochtigde GBO oh twee-stukken bovenop de gel. Zorg voor een volledig contact tussen alle lagen door met een pipette stevig over de bovenkant van de stapel te rollen.

Plaats aan weerszijden van de transferstapel twee verhoogde bakken met TBS en leg de vooraf bevochtigde lont over de stapel, zodanig dat beide uiteinden van de lont ondergedompeld zijn in TBS. Dek de geassembleerde transferstapel af met een extra plastic tray waarop een gewicht is geplaatst, zoals een fles water van 500 ml. De lont zal buffer uit de bakken trekken en het droge blotpapier zal de buffer gedurende enkele uren door de gel trekken.

Hierdoor worden de eiwitten op het membraan afgezet; laat de overdracht minimaal drie uur of overnacht doorgaan. Nadat de capillaire overdracht is voltooid, kan het membraan worden verwerkt via standaard western blotting. Hier ziet u een typische blot van eiwitten die werden overexpressie in een giststam die bepaalde eiwitten predisponeert voor de vorming van amyloïde.

U kunt duidelijk zien dat sommige van onze kandidaten zeer goed amyloïde of SDS-resistente soorten met een hoog molecuulgewicht vormen, zoals hier en hier getoond. Anderen vormen echter geen aggregaten en zijn volledig monomeer, zoals deze en deze. Daarnaast is te zien dat de grootte van de amyloïde polymeren verschilt afhankelijk van het eiwit, wat u kunt zien in deze twee banen.

We hebben zojuist een eenvoudige methode gedemonstreerd voor het analyseren van onoplosbare aggregaten met een hoog molecuulgewicht, zoals amyloïden van kandidaat-prionen. We hopen dat u onze presentatie met interesse heeft bekeken en dat u deze techniek nuttig vindt voor studies naar immunogene amyloïde-eiwitten. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw onderzoek.