Gemethyleerd DNA Immunoprecipitatie

Deze video demonstreert een protocol voor gemethyleerde DNA-immunoprecipitatie of MeDIP. Een methode die wordt gebruikt om op een onbevooroordeelde wijze specifiek gemethyleerd DNA te isoleren. DNA-methylering bij zoogdieren wordt gekenmerkt door de toevoeging van een methylgroep aan de C5-positie van cytosine.

Wanneer het aanwezig is in een CpG-dinucleotide, is het een reversibele epigenetische markering die een belangrijke rol speelt bij de normale ontwikkeling, evenals bij verschillende ziekteprocessen. Normale functies van DNA-methylering omvatten X-chromosoom-inactivering bij vrouwtjes, het uitschakelen van repetitieve elementen, genomische imprinting en het behoud van genomische stabiliteit. DNA-methylering is bovendien aangetoond als een factor bij talrijke ziekten, zoals kanker, het syndroom van de Angelman, het syndroom van Prader-Willi en het centrumere instabiliteit- en gelaatsafwijkingssyndroom.

In kankers kan bijvoorbeeld abnormale hypermethylering van promotors leiden tot het uitschakelen van vitale tumorsuppressorgenen. Terwijl onjuiste hypomethylering resulteert in chromosomale instabiliteit en activatie van oncogenen, wordt de voorbereiding voltooid door het DNA eerst via sonicatie in fragmenten te splitsen met een grootte variërend van 300 tot 1000 baseparen. Het gesoniceerde DNA wordt vervolgens gedenatureerd bij 95 °C.

Primaire antilichamen, die vijf-methazine herkennen, worden toegevoegd om zich te kunnen binden aan gemethyleerde DNA-fragmenten. Secundaire antilichamen, geconjugeerd aan magnetische dyna-beads, worden gebruikt om de DNA-fragmenten te isoleren die door het primaire antilichaam zijn gebonden. Ongemethyleerde fragmenten worden verwijderd en de antilichamen worden afgebroken door proteinase.

Reiniging met fenol-chloroform verwijdert het verteerde eiwit en precipitatie zuivert het DNA, dat nu is verrijkt met gemethyleerde fragmenten. Vervolgens kan het DNA worden gebruikt voor toepassingen zoals PCR-microarray en sequencing. De procedure wordt over het algemeen uitgevoerd over een periode van twee dagen.

Dag één omvat de DNA-preparatie, sonicatie, immunoprecipitatie en proteïnedigestie. Dag twee omvat pH-chloroformextractie en ethanolprecipitatie om het DNA dat is verrijkt voor methylering te zuiveren en te isoleren. Er zijn enkele speciale materialen nodig voor de uitvoering, waaronder gesiliconiseerde centrifugebuisjes, een DNA-sonicatieapparaat, een primaire antilichaam, anti-5'-methylcytosine muis monoklonaal antilichaam, een secundair antilichaam, Dynabeads geconjugeerd aan schaap anti-muis IgG en een magnetisch buisjesrek.

De eerste stap in het meet-up-protocol is de preparatie van DNA. Het is essentieel om vooraf de aard van het DNA te beoordelen. Kennis van de toestand van het monster-DNA, of het nu primair dubbel- of enkelstrengs is, is vereist aangezien een nauwkeurige kwantificering van het monster van het grootste belang is en verschillende methoden voor het bepalen van de DNA-hoeveelheid nadelig kunnen worden beïnvloed door de aanwezigheid van ongewenste DNA-soorten.

De hoeveelheid dubbelstrengs DNA kan eenvoudig worden bepaald via spectrale fotometrie met een NanoDrop 3000; breng 1,5 µL aan en stel het meettype in op nucleïnezuur, selecteer DNA 50 als berekening en initialiseer het instrument met 1,5 µL water. Reinig de pedestals en nul het instrument met 1,5 µL van de vloeistof. De monsteroplossing is gereed; reinig de pedestals, breng 1,5 µL van het monster aan en druk op meten.

De concentratie wordt gegeven en kan worden gebruikt. Om het aantal microliters te berekenen dat ik nodig heb, is een A$_{260}$/A$_{280}$-verhouding van 1,8 hier ideaal. Er wordt een monster van 1 µg voorbereid.

Een monster van slechts 200 nanogram is echter voldoende om succesvolle resultaten te verkrijgen. Laad het DNA-monster in een schone gesiliconeerde buis. Voeg voldoende steriel water toe om het uiteindelijke volume op 50 microliters te brengen.

DNA-sonificatie en immunoprecipitatie moeten worden uitgevoerd in gesiliconiseerde buisjes om aspecifieke binding van DNA en eiwitten aan de wanden van de buisjes te voorkomen. Zodra het DNA is voorbereid, moet het monster worden gesonificeerd; sonificatie is vereist om het DNA te fragmenteren, aangezien immunoprecipitatie efficiënter is met kleinere DNA-fragmenten. Plaats het monster in de sonicator, zorg dat de vermogensinstelling op hoog staat en dat de machine is ingesteld op 30 seconden aan en 30 seconden uit. Vul de basis tot aan de vullijn met water van 4 °C.

Sonicate het monster gedurende zeven minuten. Wanneer de sonicatie is voltooid, neemt u de buis uit de apparaat en plaatst u deze op ijs. Het is belangrijk om de sonicatiecondities vooraf te optimaliseren voor uw verwachte monster en DNA-grootte.

Een gedeeltelijk gedegradeerd DNA-monster vereist bijvoorbeeld een kortere sonicatietijd. Sonicatieproducten kunnen worden gevisualiseerd met standaard elektroforetische technieken. Op dit punt zijn DNA-fragmenten met een lengte variërend van 300 tot 1000 baseparen gewenst voor later gebruik.

Bij microarray- en PCR-analyses dient u één vijfde van uw DNA te reserveren om als input- of referentiedna te dienen; in dit geval worden 800 nanogram gesoniceerd DNA gebruikt voor de immunoprecipitatie en wordt de rest apart gezet als referentiedna. De volgende stap in het mediaprotocol is de immunoprecipitatie of IP-reactie; voordat het primaire antilichaam wordt toegevoegd, moet het DNA worden gedenatureerd. Denaturatie is noodzakelijk omdat het primaire antilichaam gevoelig is voor enkelstrengs DNA.

Plaats de monsterbuis 10 minuten in een waterbad van 95 °C. Zodra de denaturatiestap is voltooid, dient de buis onmiddellijk voor ten minste vijf minuten op ijs te worden geplaatst. Dit voorkomt dat het gedenatureerde DNA weer anneleert en zorgt voor een optimale antilichaambinding zodra het monster is afgekoeld.

Centrifugeer de buis kort om de inhoud naar de bodem te trekken. Voeg vervolgens het primaire antilichaam toe. De hoeveelheid gebruikte antilichamen moet worden getitreerd voor elke batch en voor elke fabrikant.

In dit geval voegen we vijf microgram primair antilichaam toe en voegen we vervolgens immunoprecipitatiebuffer of IP-buffer toe tot een eindvolume van 500 µL. Vervolgens wordt het IP-DNA in een rotator geplaatst en twee uur geïncubeerd bij vier °C. Rotatie is noodzakelijk om klontering van antilichamen in de buis tijdens de incubatie te voorkomen.

Ongeveer 15 minuten voordat de incubatie van het primaire antilichaam is voltooid, worden de magnetische dyna beads gereinigd en voorbereid. Resuspendeer eerst de beads in het vial grondig door middel van vortexen. Draag vervolgens 30 µL beads over naar een schone gesiliconiseerde buis en plaats deze buis op een magnetisch rek voor meerdere reacties.

Breng 30 µL beads per reactie over, plus voldoende voor één extra reactie om rekening te houden met pipetteerfouten of onbedoeld verlies van beads. Voor acht reacties worden bijvoorbeeld voldoende beads voor negen reacties of 270 µL overgebracht.

De magnetische kralen zullen naar de wand van het magnetische rek worden getrokken. Wacht twee minuten zodat de kralen kunnen migreren en zich kunnen nestelen in een duidelijke streep op de wand van de buis. Verwijder vervolgens het supernatant met een pipet en gooi dit weg; wees hierbij voorzichtig om te voorkomen dat de kralen op de achterwand met de pipetpunt worden verstoord.

Vervang het supernatant door een overmaat aan IP-buffer, vortex en plaats het opnieuw op het magnetische rek gedurende twee minuten. Herhaal deze wasstap nogmaals en resuspendeer de waskralen in hun oorspronkelijke volume IP-buffer. Haal de monsterbuis uit de rotator wanneer de incubatie is voltooid.

Om de immunoprecipitatie te voltooien, voegt u 30 µL schone beads toe aan de reactie en plaatst u de buis opnieuw in een rotator voor twee uur bij 4 °C. Tijdens deze incubatie zal het secundaire antilichaam, dat anti-muis IgG is, binden aan het primaire muisantilichaam. De anti-muis-antilichamen zijn geconjugeerd aan magnetische dyna beads, waardoor de gebonden producten eenvoudig kunnen worden teruggewonnen en de daaropvolgende zuiveringsstap kan worden uitgevoerd.

Zodra de incubatie met beide antilichamen is voltooid, plaatst u de IP-buis gedurende twee minuten op het magnetische rek. Op dit punt is het gemethyleerde DNA gebonden aan het primaire antilichaam, dat op zijn beurt is gebonden aan het met dyna beads geconjugeerde secundaire antilichaam. Verwijder en gooi het supernatant weg en vervang dit door 500 µL IP-buffer.

Meng de inhoud van de buis en plaats deze gedurende twee minuten terug in het rek. Herhaal deze wasstap nog een keer met IP-buffer. Nadat het supernatant van de laatste wasstap is verwijderd, worden de beads voor de laatste keer geresuspendeerd.

Behandel de reactie in 400 µL digestiebuffer met 100 µg proteinase K en incubeer dit een nacht bij 50 °C. De behandeling met proteinase K is noodzakelijk om de antilichaameiwitten en elk resterend eiwit dat aan het DNA is gebonden te verteren, zodat het gemethyleerde DNA in de oplossing vrijkomt. De DNA-zuivering wordt op de tweede dag van de procedure uitgevoerd; haal de digestiebuis uit de incubator.

Voeg in een zuurkast 500 µL fenol-chloroform (1:1) bij pH 7 toe aan de buis en vortex grondig. Centrifugeer de buis 10 minuten bij 13.000 ×g. Verwijder voorzichtig de bovenste waterige fase uit de buis zonder de interface te verstoren of delen van de organische laag te verwijderen. Draag de waterige fase over naar een nieuwe buis.

Een tweede extractie kan worden uitgevoerd als de interface troebel lijkt. Voeg vervolgens één tiende volume van drie molair natriumacetaat toe, in dit geval 40 µL. Eén µL glycogeen kan als drager worden gebruikt om het opzuiveren van het pellet te vergemakkelijken.

Vortex de buis om de inhoud te mengen. Voeg vervolgens twee volumes 100% ethanol toe, vortex en vries het gedurende 20 minuten in bij -20 °C. Na het invriezen wordt het geprecipiteerde DNA gecentrifugeerd bij 13.000 G en 4 °C gedurende 20 minuten.

Er zal zich een DNA-pellet vormen op de bodem van de buis. Haal de buis uit de centrifuge en verwijder de ethanol. Let erop dat het pellet op de bodem van de buis niet wordt verstoord.

Een korte centrifugeerstap (pulse spin) kan nodig zijn om eventueel resterende ethanol te verwijderen. Voeg om de pellet te wassen 500 µL koude, 70% ethanol toe, vortex en centrifugeer opnieuw gedurende 20 minuten bij 13 000 G en 4 °C. Wanneer de tweede centrifugeerstap is voltooid, wordt de 70% ethanol via een korte centrifugeerstap verwijderd en wordt de resterende ethanol met een pipet afgevoerd.

Plaats de buis in een rek met de dop open om het pellet te laten drogen en de resterende ethanol te laten verdampen. Resuspendeer tot slot het pellet, dat uitsluitend DNA bevat dat is verrijkt voor methylering, in 10 µL steriel water en geef het DNA-pellet voldoende tijd om op te lossen voor gebruik. Het is raadzaam om de efficiëntie van de recovery te valideren via PCR.

Dit kan worden gedaan door PCR-reacties uit te voeren die zijn ontworpen om producten te amplificeren die gemethyleerde en ongemethyleerde DNA-fragmenten differentieel illustreren voor amplificerende primers van normaal menselijk DNA. De H 19 imprinting control region kan worden gebruikt in combinatie met primers die zijn ontworpen om een regio van het genoom te amplificeren die niet gemethyleerd is. Voorbeelden van primersequenties en PCR-cyclusomstandigheden kunnen worden gevonden in het bijbehorende protocol.

Op dit punt is het noodzakelijk om het input- of referentie-DNA terug te halen dat aan het begin van het meetup-protocol apart was gezet. Eén set PCR-reacties wordt opgezet met het input-DNA, en de andere set met het voor methylering verrijkte IP-DNA. Als de meetup succesvol was, zal de IP-PCR een product opleveren met de methyleringsprimers en geen product met de controleprimers.

Omgekeerd zou de input-PCR producten moeten genereren met behulp van beide primers, aangezien deze zowel gemethyleerde als ongemethyleerde DNA-fragmenten bevat. DNA dat verrijkt is met gemethyleerde fragmenten kan worden gebruikt voor diverse downstream-applicaties, zoals PCR-sequencing en microarray-analyse.

Wanneer het wordt gecombineerd met andere moleculaire biologische technieken, kan het worden gebruikt om de methyleringsstatus van DNA op een locus-specifieke of genoombrede manier te onderzoeken voor methyleringsprofilering of het bestuderen van de epigenomica.