Een techniek voor seriële verzamelen van hersenvocht uit de Cisterna Magna in de muis

De procedure begint met het anesthetiseren van de muis en de voorbereiding van de chirurgische plaats. De muis wordt vervolgens in buikligging op het stereotaxisch instrument geplaatst. Er wordt een sagittale incisie in de huid gemaakt onder het occiput, waarna het onderhuidse weefsel en de nekspieren via de middenlijn stomp worden gescheiden.

Vervolgens wordt het achterste deel van het lichaam neergelegd zodat het lichaam een hoek van 135 graden vormt met de gefixeerde kop, waarna de dura mater van de CI sternum magna met de glazen capillair wordt gepenetreerd en het CSF wordt opgevangen. Na de CSF-afname worden de spieren opnieuw uitgelijnd en de huid gehecht, waarbij ongeveer één milliliter 0,9%NACL zoutoplossing subcutaan wordt geïnjecteerd om uitdroging te voorkomen, en de muis wordt warm gehouden tot het herstel. Hallo, mijn naam is Liu van het lab van Dr. Karen Duff aan The Top Institute van Columbia University.

Vandaag laat ik u zien hoe u cerebrospinaalvloeistof kunt afnemen via de cisterna magna van de muis. Met deze techniek kunnen we tot drie keer seriële CSF-monsters verzamelen van dezelfde muis met intervallen van twee tot drie maanden. In ons laboratorium gebruiken we deze techniek om de CSF-amyloïd bèta- of tau-spiegels te bepalen op verschillende leeftijden van onze transgene muismodellen voor de ziekte van Alzheimer, en we correleren deze waarden met die van de hersenen.

Uiteindelijk zijn we geïnteresseerd in het potentieel van CSFA beta- of tau-niveaus als potentiële biologische markers voor de ziekteprogressie en ook voor de therapeutische trials in de muizen. Laten we beginnen. Voor deze procedure is het noodzakelijk om capillairen te maken met een micropipetpolarisator.

De hier gebruikte capillairen zijn BOA silicaatglas B 175 10 van Sutter Instruments; trek de capillairen op een Sutter P 87 flaming micro pipette puller met de hitte-index ingesteld op 300 en de drukindex ingesteld op 30. De glazen capillair is vijf centimeter lang en heeft een taps toelopende tip. De tip van de capillair wordt met een schaar afgeknipt zodat de binnendiameter ongeveer 0,5 millimeter is.

De chirurgische procedure begint met het anesthetiseren van de muis met ketamine 100 mg/kg en xylazine 10 mg/kg, intraperitoneaal toegediend; houd de muis tijdens de anesthesie warm in een incubator van 37 °C. Nadat is vastgesteld dat het dier volledig is geanestheseerd via een terugtrekreflex bij een knijptest van de teen, wordt de nek geschoren en wordt de muis vervolgens op het stereotaxische instrument geplaatst, zoals dit exemplaar van David Kink. Plaats een rectale temperatuursensor in direct contact met het warmtekussen, zodat de warmte van het kussen kan worden aangepast aan de lichaamstemperatuur van de muis.

Zet de kop vast met de kopadapters, reinig de huid van de nek drie keer met 10% povidonjodium en 70% ethanol en maak een sagittale incisie inferieur aan het achterste deel van de kop of het occiput. De volgende stappen moeten worden uitgevoerd onder een dissectiemicroscoop met behulp van stompe pincetten. Scheid het subcutane weefsel en de spieren M door ventrale services en M rectus capita dorsalis major zodat de dura mater van het sternum magna wordt blootgesteld. Gebruik micro-retractoren op de juiste wijze om de spieren uit elkaar te houden.

Leg de muis ten slotte neer met de kop in een hoek van 135 graden ten opzichte van het lichaam. De muis is nu klaar voor de afname van CSF. Deze techniek voor het verzamelen van CSF uit de cisterna magna is eerder gepubliceerd.

C figuur één A onder de dissectiemicroscoop. De dura mater verschijnt als een glanzende en heldere omgekeerde driehoek waardoor de medulla oblongata en een groot bloedvat zichtbaar zijn. Arteria dural spinella C figuur één B. De circulatoire pulsatie van de medulla en de aangrenzende CSF-ruimte is zichtbaar.

Dep de dura mater droog met een steriel wattenstaafje, penetreer met de capillaire de cisterna magna door de dura mater, lateraal van de arteria dorsalis spinalis. Er zal een merkbare verandering in weerstand optreden wanneer de capillaire correct wordt ingebracht, waarna CSF in de capillaire zal stromen. Nadat de CSF is verzameld, dient de capillaire voorzichtig te worden verwijderd en te worden verbonden met een spuit van drie milliliter met behulp van polyethyleenbuisjes met een interne diameter van één millimeter.

Inject de CSF in een buisje van 0,5 milliliter. Label het buisje en vries het onmiddellijk in op droogijs. Zodra het bevroren is, brengt u de CSF over naar een vriezer van minus 80 °C.

De zojuist gedemonstreerde bemonsteringstechniek is uiterst mild en maakt het mogelijk om gedurende een periode van twee tot drie maanden opeenvolgende CSF-monsters van dezelfde muis af te nemen. Nadat de bemonstering in de nek is voltooid, moeten de spieren en de huid opnieuw worden uitgelijnd en met hechtingen worden gesloten. Nadat de incisie is gehecht, dient er ongeveer één milliliter zoutoplossing 0,9% NACL subcutaan te worden geïnjecteerd om de muis te rehydrateren.

Houd de muis warm bij ongeveer 37 °C tot deze is hersteld. Controleer het gewicht op dag één en dag zeven na de operatie. Ik heb u zojuist laten zien hoe u cerebrospinale vloeistof uit de cisterna magna van de muis kunt afnemen.

Bij het uitvoeren van deze procedure zijn er drie belangrijke zaken om te onthouden. Ten eerste: positioneer de kop en het lichaam van de muis correct op het stereotactische frame, zodat de ator van de Cy Magna zo veel mogelijk kan worden blootgesteld. Ten tweede: vermijd zorgvuldig de bloedvaten wanneer u de durometer met de capillaire doorboort.

Anders raakt uw monster verontreinigd door het bloed. Tot slot is het belangrijk om de muizen tijdens de gehele procedure warm te houden om hypothermie te voorkomen. Hypothermie is niet alleen schadelijk voor de muizen, maar kan uw resultaten ook significant beïnvloeden door een bèta-productie of een tall hypo-fosforyleringsrelatie te induceren.

Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.