Artykuł metodologiczny

Izolacja subpopulacji rybosomów subkomórkowych na podstawie rekombinowanego oznaczenia peptydowego tag-specyficznej lokalizacji ograniczonej iluminacji zwiększonej biotynilacją

DOI:

10.3791/66881

⸱

24 lipca 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics, Stanford School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi) to nowoczesna optogenetycznie aktywowana metoda opracowana w celu znakowania i oczyszczania powinowaczo-afinicznego subkomórkowych populacji rybosomów dla sekwencjonowania i analizy proteomicznej w dalszym biegu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rosnące dowody sugerują, że translacja mRNA jest procesem silnie skompartmentalizowanym w komórce, a subkomórkowe transportowanie i lokalizacja określonych mRNA jest kluczowym czynnikiem dla zapewnienia, że białka o funkcjach specyficznych dla kompartmentów są produkowane w idealnym środowisku i w odpowiednich ilościach. Jednak techniki do subkomórkowego izolowania i charakteryzacji rybosomów, które translacjują te mRNA, były do tej pory ograniczone, co oznacza, że wiele pozostaje nieznane w kwestii tego, jak skład maszyn translacyjnych przyczynia się do regulacji zlokalizowanej translacji mRNA.

Przedstawiamy tutaj AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi), metodę łączącą tagowanie epitopowe, nowo opracowaną optogenetycznie aktywowaną podzieloną ligandę biotyny oraz afinicyjną czyszczenie, aby szybko i specyficznie oznaczyć i odizolować rybosomy zlokalizowane w dowolnym subkomórkowym oddziale zainteresowania. Po pierwsze, edycja CRISPR/Cas9 jest używana do fuzji peptydu AviTag, miejsca kleienia proteazy z wirusa wycinarki tytoniu (TEV) oraz epitope tag FLAG z białkiem rybomalnym. Podzielona liganda biotyny, zfuzjonowana z domeną ukierunkowaną na organelle, jest ekspresowana w tej linii komórkowej i jest nieaktywna pod normalnymi stężeniami biotyny. Po aktywowaniu przez suplementacyjną biotynę i niebieskie światło, ligaza biotynyluje rybosomy z tagiem Avi w bezpośrednim otoczeniu, umożliwiając afinicyjne czyszczenie biotynylowanych rybosomów oraz skojarzonych białek i mRNA na perłach pokrytych streptawidyną. Niedenaturująco eluowane za pomocą kleienia proteazy TEV daje próbki nadające się do dalszej charakteryzacji białek rdzeniowych rybosomów, białek skojarzonych z rybosomami oraz wiązanych z rybosomami mRNA za pomocą sekwencjonowania RNA lub proteomiki spektrometrii mas.

W tym protokole przeglądamy zasady projektowania fuzji AviTag z białkiem rybomalnym oraz ukierunkowania enzymu podzielonej ligandy biotyny na organelle zainteresowania. Demonstrujemy aktywację systemu ALIBi, lizę komórkową, afinicyjne czyszczenie oraz eluowane próbek. Na koniec omawiamy typowe wyniki i rozwiązywanie problemów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje istotna potrzeba narzędzi, które mogą izolować próbki biologiczne z określonych podkomórkowych działów, aby lepiej zbadać, jak organizacja podkomórkowa i transport wpływają na procesy komórkowe. Translacja mRNA jest kluczowym przykładem takiego procesu: rosnące dowody sugerują, że translacja jest wysoce skomponowana i w szczególności, że wiele mRNA jest zlokalizowanych w organellach, gdzie będą przebywać ich zakodowane białka1,2. Jednakże mniej wiadomo o podkomórkowej lokalizacji maszyn translacyjnych. Rybosomy zaczynają swoje istnienie w jądełku i jądrze, gdzie zaczyna się ich montaż z białek rybosomalnych (RP) i rybosomalnych RNA (rRNA). Następnie są eksportowane do cytoplazmy na końcowe etapy montażu, po których zaczynają translację mRNA3,4. Kanoniczne miejsca translacji obejmują cytoplazmę i siateczkę śródplazmatyczną; w tej ostatniej syntetyzowane są białka integralne błony i białka przeznaczone do organelli związanych z błoną lub wydzielania pozakomórkowego5. Niedawno zidentyfikowane miejsca lokalnej translacji obejmują mitochondria, peroksysomy i przewody neuronalne6,7,8,9,10,11,12. Interesujące jest to, że pojawiają się również dowody na to, że cechy maszyn translacyjnych, takie jak białka związane z rybosomami, modyfikacje posttranslacyjne, modyfikacje rRNA i niekanoniczne stechiometrie rdzeniowych białek rybosomalnych, są zaangażowane w mechanizmy regulacyjne, które rządzą translacją określonych mRNA oraz parametrami takimi jak wierność i szybkość translacji13,14,15,16,17,18,19,20. Na przykład zidentyfikowano setki białek, które współpracują z rybosomem i mogą potencjalnie prowadzić do różnic w składzie podkomórkowych rybosomów13. Jednakże techniki izolowania subkomórkowych populacji rybosomów były ograniczone do tej pory; tym samym wiele pozostaje nieznane na temat tego, jak skład maszyn translacyjnych przyczynia się do regulacji lokalnej translacji mRNA. Pojawienie się wszechstronnych metod izolowania subkomórkowych populacji rybosomów, szczególnie tych kompatybilnych z modelowymi systemami ssaków, pozwoli na badanie tych cech maszyn translacyjnych na poziomie subkomórkowym.

Najstarsze metody izolowania subkomórkowych ułamków zawierających rybosomy były oparte na zasadach sekwencyjnej lizy i wirowania21,22. Zazwyczaj te metody są ograniczone do określonych organelli i często wymagają długiego czasu przetwarzania. Nowsza metoda opiera się na ligazie biotynowej BirA, która specyficznie biotynyluje substrat peptydu AviTag10,23,24. BirA może być genetycznie zlokalizowany w organelli zainteresowania w komórkach, gdzie rybosomy zostały oznaczone AviTag. Jednakże, ponieważ BirA jest aktywna w fizjologicznych stężeniach biotyny, konieczne jest hodowanie komórek w warunkach niedoboru biotyny, aby uniknąć konstytutywnego i niespecyficznego biotynylacji rybosomów z AviTag10,24. To ogranicza użycie BirA w typach komórek, które są wrażliwe na niedobór biotyny25. Wreszcie, opracowano promiskualne metody biotynylacji, które wykorzystują inżynieryjne enzymy takie jak BioID, TurboID i APEX26,27,28. Po indukcji, te enzymy produkują reaktywny produkt pośredni biotyny, który kowalenie modyfikuje dowolne reszty lizyny w promieniu enzymu. Promiskualne metody biotynylacji są bardzo przydatne do mapowania proteomów podkomórkowych, ale mniej pokazujące na różniczenie białek w ogólnej okolicy zlokalizowanego rybosomów w przeciwieństwie do białek, które są w bliższej odległości z nimi.

Tutaj, prezentujemy naszą niedawno opracowaną metodę oznakowania i izolowania subkomórkowych populacji rybosomów, zwaną AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi). Ta metoda wykorzystuje inżynieryjny podzielony BirA związany z optogenetycznie ulepszonymi przełącznikami Magnet (eMag) (Rysunek 1A), które heterodimeryzują pod oświetleniem niebieskim29; i tag peptydu składający się z epitopu FLAG, miejsca kleizenia proteazy wirusa wycięcia tytoniu (TEV) i AviTag (FTA) związanego z białkiem rybosomalnym Rpl31 (Rysunek 1B). Podzielony enzym może być genetycznie ukierunkowany na wybrane organelle, jest nieaktywny w fizjologicznych stężeniach biotyny i może być odtworzony w ciągu kilku minut po oświetleniu niebieskim i dodaniu suplementacji biotyny (Rysun

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hodowla komórek mESC

UWAGA: Przed aktywacją ALIBi i lizą komórki mESC należy obsługiwać stosując standardową sterylną technikę hodowli komórek. Wirowanie nietkniętych komórek mESC powinno odbywać się w warunkach 200 × g przez 3 min w temperaturze pokojowej, o ile nie określono inaczej. Przed użyciem nagrzewać media do 37 °C w kąpieli wodnej, o ile nie określono inaczej. Komórki mESC należy przesadzać do świeżej płytki hodowlanej pokrytej żelatyną na noc (patrz krok 1.1).

  1. Na dzień przed rozmrożeniem komórek mESC L31-FTA, pokryj dno 10-centymetrowej płytki 5 ml 0,1% żelatyny. Inkubacja w 37 °C przez noc.
  2. Połącz składniki mediów mESC (Tabela 2) i przefiltruj przez filtr o rozmiarze 0,2 μm. Przechowuj w 4 °C do 1 miesiąca.
  3. W dniu rozmrożenia, rozgrzej 5 ml alikwot mediów do rozcieńczania rozmrożonych komórek i 10 ml alikwot do ich zasiewu.
  4. Pobierz kriowialkę zawierającą ~5 × 106 komórek mESC L31-FTA z cieczy azotu i natychmiast rozmroź przez obracanie dnem kriowialki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  5. Delikatnie wymieszaj 0,5-1 ml mediów z alikwotem 5 ml z zawartością kriowialki, o ile pojemność kriowialki to pozwala, a następnie przenieś zawartość kriowialki z powrotem do 5 ml mediów.
  6. Odwiruj komórki. Odsącz nadstan.
  7. Resuspenduj pellet komórek z 10 ml alikwotem mediów.
  8. Odsącz żelatynę z 10 cm płytki i natychmiast przenieś zawiesinę komórek do płytki. Inkubacja w 37 °C.
  9. Co 24 godziny (z wyjątkiem dni przesadzania), odsącz stare medium z płytki i wymień na 10 ml świeżego mediów.
  10. Kiedy kolonie osiągają 70-80% konfluencji (zwykle 48 godzin po zasianiu), odsącz stare medium i dwukrotnie przepłucz 10 ml buforu fosforanowego Dulbecco (DPBS).
  11. Po odsączeniu DPBS, pokryj płytkę 2 ml 0,05% trypsyny (Tabela 2). Inkubacja w 37 °C przez 5 min.
  12. Neutralizuj trypsynę dodając 4 ml zimnego mediów mESC do płytki. Natychmiast użyj 5 lub 10 ml pipety serologicznej do przepompowywania w górę i w dół 15x w płytce, aby odłączyć kolonie w jednokomórkową zawiesinę.
  13. Przenieś zawiesinę do stężonej epruwetki. Opcjonalnie, pobierz alikwot do zliczenia komórek za pomocą licznika komórek.
  14. Odwiruj komórki. Odsącz nadstan.
  15. Resuspenduj pellet komórek w świeżym medium. Przesadź 5 × 106 komórek (zwykle stosunek przesadzania 1:6) do świeżej pokrytej żelatyną 10 cm płytki i inkubacja w 37 °C. Powtórz kroki 1.9-1.15 w miarę potrzeby, aż będzie gotowy do przejścia do transfekcji.
  16. Aby zamrozić kultury komórek, trypsynizuj płytkę mESC (jak w krokach 1.10-1.14). Resuspenduj pellet komórek w medium do zamrażania (250-500 μl na 5 × 106 komórek), podziel na kriowialki i powoli zamroź w pojemniku do zamrażania komórek w -80 °C przez noc przed przeniesieniem do cieczy azotu.

2. Transfekcja

UWAGA: Przeprowadź transfekcję w dniu, w którym komórki mESC są gotowe do przesadzenia. Plasmidy mogą zacząć się ekspresować już 3-5 godzin po transfekcję. Po rozpoczęciu ekspresji zalecamy obsługę komórek w ciemności i minimalizowanie narażenia na temperatury poniżej 37 °C, aby zapobiec przedwczesnej aktywacji, ponieważ wcześniejsze prace wykazały, że domeny optogenetyczne Magnet dimerizują nie tylko pod wpływem niebieskiego światła, ale także po ekspozycji na zimno31. Trzymaj płytki w dedykowanym inkubatorze lub zabezpiecz półkę w wspólnym inkubatorze przed światłem folią aluminiową. Podczas obsługi komórek spoza inkubatora, włącz lub zablokuj wszystkie światła w pokoju i okna przed ręką, a do widzenia użyj czerwonego lampki na głowę. Nie zostawiaj otwartych drzwi inkubatora dłużej niż konieczne. Wyjmuj tylko małe partie płytek z inkubatora na raz i opieraj płytki na izolującej powierzchni (np. czysta pokrywa pudełka styropianowego), podczas gdy obsługujesz, aby zminimalizować kontakt z powierzchniami roboczymi w temperaturze pokojowej. W pełni rozgrzej medium przed użyciem. Nie inspekcjonuj płytek w mikroskopie emitującym światło.

  1. Na dzień przed transfekcją, pokryj 10 cm płytkę żelatyną.
  2. W dniu transfekcji, odsącz żelatynę z płytki i dodaj 7,5 ml mediów do nagrzania w 37 °C. Nagrzej zredukowane medium bez surowicy w 37 °C do resuspendowania komórek.
  3. Rozcień 18,75 μl reagentu transfekcyjnego w 250 μl zredukowanego medium bez surowicy. Delikatnie potnij, aby wymieszać

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Western blot (sekcja 6 protokołu) jest najszybszym sposobem wstępnej oceny powodzenia eksperymentu. Po inkubacji membran ze streptawidyną-HRP, lizat z komórek, w których obecne były wszystkie komponenty systemu, powinien zawierać prążek odpowiadający biotynglowanemu L31-FTA (Rysunek 2A, ścieżka 20). Ten sam prążek, zazwyczaj o większym natężeniu, powinien być obecny, jeśli komórki zostały transfektowane pełnowymiarową BirA jako kontrolą pozytywną (Rysunek 2A, śc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ALIBi oferuje kilka zalet w stosunku do istniejących technik badania translacji subkomórkowej i ma potencjalne przyszłe zastosowania w biologii rybosomów i poza nią. Ten protokół wymaga podobnego lub mniejszej ilości czasu w porównaniu z sekwencyjnym lizysem i wirowaniem21,22 i jest potencjalnie stosowany do każdego subkomórkowego zespołu, który może być genetycznie ukierunkowany za pomocą sekwencji peptydowej lokalizacyjnej. W porównaniu z konstytutywnie aktywny...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konfliktów interesów do zadeklarowania.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują członkom Barna Lab za pomocne dyskusje.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
-80 °C składowanieDo hodowania komórek
0,1% żelatyna w wodzieMilliporeSigmaES-006-BDo hodowania komórek
Filtry 0,2 µmFisher04-977-158Do hodowania komórek
0,5% trypsyna-EDTA (10X)ThermoFisher15400-054Do hodowania komórek
1 M MgCl2ThermoFisherAM9010Do lizy i czyszczenia pokrewnego
1 M Tris pH 7,5ThermoFisher15567027Do lizy i czyszczenia pokrewnego
1 M Tris pH 8ThermoFisherAM9855GOpcjonalnie: do wstawiania FTA w endogenne locus białka rybosomalnego
1,5 i 2 mL probówki mikrowirówkowe, autoklawowaneDo transfekcji
1,5, 2 mL i 5 mL probówki mikrowirówkowe do białek o niskiej adsorpcjiEppendorf022431081, 022431102,
0030108302		Do lizy i czyszczenia pokrewnego
10 cm naczynia do hodowli tkankowejDo hodowania komórek
10 M NaOHMilliporeSigma72068-100MLDo lizy i czyszczenia pokrewnego
10x bufor Tris/glicyna/SDSBio-Rad1610772Do Western blot
37 °C inkubator do hodowli tkankowej x 2Do hodowania komórek. Jeden z nich służy jako główny inkubator do hodowli komórek i iluminacji transfekowanych komórek. Tymczasowa przestrzeń jest potrzebna w drugim inkubatorze w dniu aktywacji ALIBi, aby pomieścić transfekowane komórki podczas przygotowywania transiluminatora w głównym inkubatorze.
37 °C kąpiel wodnaDo hodowania komórek
5 M NaClThermoFisherAM9010Do lizy i czyszczenia pokrewnego
50 mM biotinThermoFisherB20656Do lizy i czyszczenia pokrewnego
6x bufor LaemmliFIsher50-196-784Do Western blot
70% etanolDo dezynfekcji
AcetonitrylFisherA955Opcjonalnie: do przygotowania próbek do spektrometrii masowej
Zestaw AcTEV proteazyThermoFisher12575015Do lizy i czyszczenia pokrewnego
Plasmid ALiBi C-fragmentAddgene#235615, 235636 – 235641Do transfekcji potrzebny jest zestaw midi-prep
Plasmid ALiBi N-fragmentAddgene#235614, 235635, 235642, 235643Do transfekcji potrzebny jest zestaw midi-prep
Guma aluminiowaDo lizy i czyszczenia pokrewnego
Bicarbonat amonowyMilliporeSigma5.3305Opcjonalnie: do przygotowania próbek do spektrometrii masowej
Przeciwciało anty-FLAGMilliporeSigmaF3165Do Western blot
Przeciwciało anty-GAPDHCell Signaling5174Do Western blot
Przeciwciało anty-mysieGE HealthcareNA931VDo Western blot
Przeciwciało anty-króliczeGE HealthcareNA934VDo Western blot
Przeciwciało anty-Rpl12Abcamab175219Do Western blot
Przeciwciało anty-Rpl31Abcamab103991Do Western blot
Przeciwciało anty-Rpl5ProteinTech15430-1-APDo Western blot
Przeciwciało anty-V5ThermoFisherR960-25Do Western blot
ApyrazaNEBM0398LDo lizy i czyszczenia pokrewnego
Beta-merkatoprol (55 mM)ThermoFisher21985-023Do hodowania komórek
Światło transiluminatora niebieskiegoClare Research ChemicalDR46B (mały) lub DR196 (duży)Do lizy i czyszczenia pokrewnego
Albumina bydlęca (BSA)FisherBP1600-100Do Western blot
Wstążki C18 (OMIX C18 tips)AgilentA57003100Opcjonalnie: do przygotowania próbek do spektrometrii masowej
Pojemnik do zamrażania komórekDo hodowania komórek
Wirówka do probówek mikrowirówkowych o pojemności 15 mL i/lub 50 mLDo hodowania komórek
Wirówka do probówek mikrowirówkowych o pojemności 1,5-2 mLDo lizy i czyszczenia pokrewnego. Powinna być wydajna do chłodzenia do 4 C i prędkości do 17 000 g. Idealnie znajduje się w pomieszczeniu, które można tymczasowo zaciemnić podczas przenoszenia probówek wewnątrz i na zewnątrz.
Zestaw Clarity ECLBio-Rad170-5061Do Western blot
Zestaw Criterion gelBio-Rad1656001Do Western blot
Zestaw Criterion TGX wstępnie żelowanych żeli, 4-20%Bio-Rad5671095Do Western blot. Dostępne dodatkowe rozmiary i układy formacji
CykloheksymidMilliporeSigmaC7698-5GDo lizy i czyszczenia pokrewnego
DeoksicholanMilliporeSigmaS1827Do lizy i czyszczenia pokrewnego
DytiotreitolThermoFisher

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fazal FM, et al. Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-seq. Cell. 2019;178(2):473-90.e26.
  2. Padron A, Iwasaki S, Ingolia NT. Proximity RNA labeling by APEX-seq reveals the organization of translation initiation complexes and repressive RNA granules. Mol Cell. 2019;75(4):875-87.e5.
  3. Dorner K, Ruggeri C, Zemp I, Kutay U. Ribosome biogenesis factors: from names to functions. EMBO J. 2023;42(7):e112699.
  4. Klinge S, Woolford JL Jr. Ribosome assembly coming into focus. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20(2):116-31.
  5. Aviram N, Schuldiner M. Targeting and translocation of proteins to the endoplasmic reticulum at a glance. J Cell Sci. 2017;130(24):4079-85.
  6. Dahan N, et al. Peroxisome function relies on organelle-associated mRNA translation. Sci Adv. 2022;8(2):eabk2141.
  7. Koppers M, et al. Receptor-specific interactome as a hub for rapid cue-induced selective translation in axons. Elife. 2019;8:e48718.
  8. Hafner AS, et al. Local protein synthesis is a ubiquitous feature of neuronal pre- and postsynaptic compartments. Science. 2019;364(6441):eaau3644.
  9. Biever A, et al. Monosomes actively translate synaptic mRNAs in neuronal processes. Science. 2020;367(6477):eaay4991.
  10. Williams CC, Jan CH, Weissman JS. Targeting and plasticity of mitochondrial proteins revealed by proximity-specific ribosome profiling. Science. 2014;346(6210):748-51.
  11. Lesnik C, et al. OM14 is a mitochondrial receptor for cytosolic ribosomes that supports co-translational import into mitochondria. Nat Commun. 2014;5:5711.
  12. Gold VA, Chroscicki P, Bragoszewski P, Chacinska A. Visualization of cytosolic ribosomes on the surface of mitochondria by electron cryo-tomography. EMBO Rep. 2017;18(10):1786-800.
  13. Simsek D, et al. The mammalian ribo-interactome reveals ribosome functional diversity and heterogeneity. Cell. 2017;169(6):1051-65.e18.
  14. Kondrashov N, et al. Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning. Cell. 2011;145(3):383-97.
  15. Shi Z, et al. Heterogeneous ribosomes preferentially translate distinct subpools of mRNAs genome-wide. Mol Cell. 2017;67(1):71-83.e7.
  16. Genuth NR, et al. A stem cell roadmap of ribosome heterogeneity reveals a function for RPL10A in mesoderm production. Nat Commun. 2022;13(1):5491.
  17. Li H, et al. A male germ-cell-specific ribosome controls male fertility. Nature. 2022;612(7941):725-31.
  18. Milenkovic I, et al. Dynamic interplay between RPL3- and RPL3L-containing ribosomes modulates mitochondrial activity in the mammalian heart. Nucleic Acids Res. 2023;51(11):5301-24.
  19. Sloan KE, et al. Tuning the ribosome: the influence of rRNA modification on eukaryotic ribosome biogenesis and function. RNA Biol. 2017;14(9):1138-52.
  20. Simsek D, Barna M. An emerging role for the ribosome as a nexus for post-translational modifications. Curr Opin Cell Biol. 2017;45:92-101.
  21. Baghirova S, Hughes BG, Hendzel MJ, Schulz R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2015;2:440-5.
  22. Jagannathan S, Nwosu C, Nicchitta CV. Analyzing mRNA localization to the endoplasmic reticulum via cell fractionation. Methods Mol Biol. 2011;714:301-21.
  23. Fairhead M, Howarth M. Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA. Methods Mol Biol. 2015;1266:171-84.
  24. Jan CH, Williams CC, Weissman JS. Principles of ER cotranslational translocation revealed by proximity-specific ribosome profiling. Science. 2014;346(6210):1257521.
  25. Dakshinamurti K, Chalifour L, Bhullar RP. Requirement for biotin and the function of biotin in cells in culture. Ann N Y Acad Sci. 1985;447:38-55.
  26. Roux KJ, Kim DI, Raida M, Burke B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. J Cell Biol. 2012;196(6):801-10.
  27. Branon TC, et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nat Biotechnol. 2018;36(9):880-7.
  28. Rhee HW, et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 2013;339(6125):1328-31.
  29. Benedetti L, et al. Optimized Vivid-derived Magnets photodimerizers for subcellular optogenetics in mammalian cells. Elife. 2020;9:e63230.
  30. Zhang Z, et al. A subcellular map of translational machinery composition and regulation at the single-molecule level. Science. 2025;387(6738):eadn2623.
  31. Weinberg BH, et al. High-performance chemical- and light-inducible recombinases in mammalian cells and mice. Nat Commun. 2019;10(1):4845.
  32. Goldman A, Harper S, Speicher DW. Detection of proteins on blot membranes. Curr Protoc Protein Sci. 2016;86:10.8.1-10.8.11.
  33. Gravel P. Protein blotting by the semidry method. In: Walker JM, editor. The protein protocols handbook. 2nd ed. Totowa, NJ: Humana Press; 2002. p. 321-34.
  34. Kirkeby S, Moe D, Bog-Hansen TC, Van Noorden CJ. Biotin carboxylases in mitochondria and the cytosol from skeletal and cardiac muscle as detected by avidin binding. Histochemistry. 1993;100(6):415-21.
  35. Chandler CS, Ballard FJ. Multiple biotin-containing proteins in 3T3-L1 cells. Biochem J. 1986;237(1):123-30.
  36. Jaaro H, Rubinfeld H, Hanoch T, Seger R. Nuclear translocation of mitogen-activated protein kinase kinase (MEK1) in response to mitogenic stimulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94(8):3742-7.
  37. Dang CV, Lee WM. Identification of the human c-myc protein nuclear translocation signal. Mol Cell Biol. 1988;8(10):4048-54.
  38. Snaar S, et al. Mutational analysis of fibrillarin and its mobility in living human cells. J Cell Biol. 2000;151(3):653-62.
  39. Shibata Y, et al. The reticulon and DP1/Yop1p proteins form immobile oligomers in the tubular endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 2008;283(27):18892-904.
  40. Palmer AE, et al. Ca2+ indicators based on computationally redesigned calmodulin-peptide pairs. Chem Biol. 2006;13(5):521-30.
  41. Seth RB, Sun L, Ea CK, Chen ZJ. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF3. Cell. 2005;122(5):669-82.
  42. Collins JC, et al. Biotin-dependent expression of the asialoglycoprotein receptor in HepG2. J Biol Chem. 1988;263(23):11280-3.
  43. Moskowitz M, Cheng DK, Moscatello DK, Otsuka H. Growth stimulation of BHK cells in culture by free biotin in serum. J Natl Cancer Inst. 1980;64(3):539-44.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Biologianumer 233numer 233W tym miesi cu w JoVEnumer

Powiązane artykuły