Artykuł metodologiczny

Wysokowydajna tomografia szeregowa z wykorzystaniem zautomatyzowanego robota do zmiany próbek

DOI:

10.3791/68273

⸱

3 lipca 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Diamond Light Source Ltd., Harwell Science and Innovation Campus, 2Helmholtz-Zentrum Hereon GmbH, 3Natural History Museum, 4Department of Earth Science and Engineering, Royal School of Mines, Imperial College, 5Institute of Zoology, Zoological Society of London

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczegóły implementacji i procedura zbierania danych dla synchrontronowej tomografii rentgenowskiej z wykorzystaniem zautomatyzowanego robota do zmiany próbek na linii wiązki I13-2 Imaging w Diamond Light Source (DLS) są tutaj przedstawione i omówione. To znacznie poprawia przepustowość i efektywność zbierania danych linii wiązki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy rękopis opisuje przepływ pracy do automatycznego zbierania danych, który wykorzystuje ramię robotyczne do wymiany próbek, znacznie poprawiając wydajność zbierania danych. Konfiguracja, zaimplementowana dla obrazowania synchrotronowego promieniowania X na linii wiązki I13-2, Imaging w źródle Diamond Light Source (DLS), wykorzystuje robota do uzyskania wysokowydajnej tomografii szeregowej (3D) lub obrazowania (2D). Obecnie, dla wielu eksperymentów, czas potrzebny na ręczną wymianę i wyrównanie próbek jest porównywalny, lub nawet przekracza, czas trwania samego skanowania tomograficznego. Aby zmaksymalizować efektywne wykorzystanie dostępnego czasu wiązki i zwiększyć przepustowość eksperymentu, automatyzacja wymiany i wyrównania próbek jest niezbędna. Zastosowanie robota jako zmieniacza próbek może zwiększyć przepustowość o co najmniej 4-10 razy w porównaniu z procedurami ręcznymi, w zależności od wybranego rozmiaru piksela. Dzięki maszynie Diamond II i aktualizacjom wiązek I13L Operando Coherent TOmography i Ptychographic Imaging (OCTOPI), zwiększony strumień promieniowania X dalece skróci czas skanowania eksperymentalnego, czyniąc system jeszcze bardziej wydajnym. Ponadto automatyzacja umożliwia zdalne zbieranie danych, w tym opcjonalną usługę mail-in dla użytkowników. Automatyczne centrowanie próbek pozwala na całkowicie nienadzorowane skanowanie, które może być wykonywane zdalnie. Stanowi to unikalną i innowacyjną cechę systemu. Niniejszy rękopis opisuje kompletną procedurę, w tym przygotowanie próbek, montaż na specjalistycznych uchwytach, transport do linii wiązki oraz umieszczenie na dedykowanych tackach do robotycznej wymiany próbek. Przedstawiono procedurę automatycznego centrowania próbek oraz następującą po niej linię rekonstrukcji tomograficznej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Automatyzacja jest powszechnie stosowana w ciężkim przemyśle produkcyjnym od dziesięcioleci1,2,3. Jednakże oprogramowanie i sprzęt robotyczny wystarczająco się dojrzały, aby mógł poradzić sobie z bardzo delikatnymi zadaniami, takimi jak sekwencjonowanie genomu, przeprowadzanie zabiegów medycznych w szpitalach lub pomaganie w przeprowadzaniu eksperymentów chemicznych4,5,6,7. Automatyzacja nie tylko eliminuje błędy ludzkie, ale również poprawia wydajność i efektywność4.

Źródło rentgenowskie synchrotronowe generuje niezwykle jasne i wysoce spójne promieniowanie elektromagnetyczne w szerokim zakresie spektralnym od podczerwieni do twardych promieni X. Źródła te umożliwiają eksperymenty obrazowania o wysokiej przepustowości i wysokiej rozdzielczości z bardzo krótkimi czasami skanowania i dużą statystyką. Częściowa spójność może być wykorzystana do uzyskania lepszego kontrastu dla słabo absorbujących miękkich materiałów, takich jak polimery czy próbki tkankowe8,9,10 w porównaniu z źródłami rentgenowskimi laboratoryjnymi. Pełny zestaw danych tomografii rentgenowskiej – który pozwala na wizualizację obiektu w prawdziwym 3D – wymaga pozyskania projekcji próbki pod różnymi kątami. Postępy w jasności źródła, sprzęcie eksperymentalnym i sterowaniu pozwalają na czas zbierania danych w zakresie od kilkudziesięciu sekund do kilku minut8. W rezultacie, ładowanie i wyrównanie próbek stało się bardziej czasochłonne niż samo skanowanie tomograficzne11,12. Ważne jest, aby zauważyć, że ręczne zmienianie próbek w eksperymencie tomografii synchrotronowej może zająć znaczną ilość czasu (w porównaniu z czasem skanowania), ponieważ podczas wchodzenia i zamykania kabiny eksperymentalnej należy przestrzegać procedury bezpieczeństwa promieniowania. Procedura ta zazwyczaj trwa kilka minut. Ponadto wyrównanie próbek również może zająć kilka minut.

Jeśli ten proces zmiany i wyrównania próbek zostanie zautomatyzowany, zaoszczędzi to znaczną ilość czasu. Dlatego robot do zmiany próbek został zaimplementowany na linii wiązki obrazu I13-2 synchronu DLS. Niniejszy dokument opisuje pełny protokół przeprowadzania eksperymentu mikrotomografii rentgenowskiej synchrotronowej z wieloma próbkami za pomocą robota do zmiany próbek na linii wiązki obrazu I13-211,12. Ta implementacja nie tylko poprawia efektywność czasu eksperymentu, ale również umożliwia przeprowadzanie eksperymentów zdalnie. Alternatywą jest ręczna lub półautomatyczna operacja, które są znacznie wolniejsze. Tutaj, półautomatyczne oznacza użycie robota tylko do wymiany próbek bez ich wyrównania.

Znaczenie automatyzacji podkreślają projekty automatyzacji na innych liniach wiązki obrazu synchrotronowego, przy czym najbardziej podobne projekty znajdują się na linii wiązki obrazu 2BM APS13, linii wiązki obrazu SLS TOMCAT14, linii wiązki obrazu EMBL P14 na PETRA III15 oraz linii wiązki obrazu IMAGE w Karlsruhe Institute of Technology (KIT) Light Source16. W 2-BM APS, próbki wymagające skanowania za pomocą robota są montowane na standardowym mocowania kinematycznym, które jest umieszczane w tacy zmieniacza próbek o pojemności maksymalnie 60 próbek jednocześnie. Ramię chwytakowe następnie pobiera próbkę i montuje ją na etapie rotacyjnym. Jednakże wyrównanie próbek odbywa się offline za pomocą stereoskopu. Podobny system został zainstalowany na linii wiązki obrazu TOMCAT w SLS, z wyjątkiem tego, że tutaj proces jest w pełni zautomatyzowany, który może wykonać załadunek/rozładunek próbek, wyrównanie, skanowanie poprawnej strefy zainteresowania i rekonstrukcję. Całkowita liczba próbek, które można skanować jednocześnie, to 60. Niedawno linia wiązki obrazu P14 na PETRA III15 zainstalowała system zmiany próbek, który może obsłużyć miękkie biologiczne próbki o wielkości rzędu 1 mm. Pozycjonowanie i centrowanie odbywa się za pomocą procedury trzy-kliknięciowego centrowania. Na linii wiązki obrazu IMAGE w KIT, stanowisko obrazu/tomografii o wysokiej przepustowości umożliwia pomiar do 1500 okazów w ciągu dwóch dni16. W odróżnieniu od wymienionych wyżej systemów robotycznych, system linii wiązki obrazu I13-2 może obecnie obsłużyć próbki o średnicy do 8 mm i zmierzyć do 112 próbek w ciągu ośmiogodzinnej zmiany, bez interwencji człowieka, w tym automatyczne centrowanie próbek.

Obecne setup tomograficzne na linii wiązki obrazu I13-2, Diamond-Manchester Imaging beamline, zostało opisane w wymienionej publikacji17. Dla kompletności, kluczowe aspekty eksperymentów tomograficznych są podsumowane tutaj; prosimy również o zapoznanie się z R

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: W niniejszym badaniu wykorzystano okazy owadów z Muzeum Historii Naturalnej (NHM) w Londynie do porównawczej analizy fenotypowej. Okazy te zostały nabyte przez Muzeum Historii Naturalnej zgodnie ze standardowymi procedurami akwizycji, aby upewnić się, że okazy zostały pozyskane i przekazane legalnie.

1. Planowanie eksperymentu

  1. Sprawdź wykonalność przeprowadzenia eksperymentów tomograficznych lub obrazowych na próbce, która Cię interesuje na linii wiązki I13-2, kontaktując się z personelem linii wiązki za pomocą następującego linku: https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Imaging-and-Microscopy/I13-2/Staff.html .
  2. Prześlij wniosek w celu uzyskania terminu na przeprowadzenie zaplanowanego eksperymentu, korzystając z następującego linku: https://www.diamond.ac.uk/Users.html.
  3. Dyskutuj nad przygotowaniem próbki i procesem pomiaru próbki z personelem linii wiązki po zaakceptowaniu wniosku i zaplanowaniu eksperymentu. Eksperymenty przeprowadzane za pomocą robota mają pewne wymagania, które są podawane w następnej sekcji (sekcja 2).
  4. Dyskutuj nad wymiarami i składem próbki z personelem linii wiązki, aby upewnić się, że eksperyment może zostać przeprowadzony pomyślnie na linii wiązki.
  5. Rozpocznij przygotowania do wizyty eksperymentalnej z dużą wyprzedzeniem, postępując zgodnie z instrukcjami na stronie internetowej (https://www.diamond.ac.uk/Users.html).
  6. Ukończ szkolenie z bezpieczeństwa przed sesją eksperymentalną.

2. Przygotowanie próbki (dla eksperymentów z użyciem robota)

  1. Przygotuj kompatybilne z SPINE Podstawy Próbek18 do montażu próbek. Zamontuj każdą próbkę na standardowej podstawie próbki w stylu SPINE wyposażonej w kod kreskowy Data Matrix, aby umożliwić automatyczne śledzenie próbek.
  2. Zamocuj próbkę do podstawy za pomocą jednej z dwóch konfiguracji. Mocowanie na kołku: Zamontuj próbkę na kołku w stylu SPINE (patrz Rysunek 1C, dołączony). Mocowanie w pojemniku lub bezpośrednie: Umieść próbkę wewnątrz kompatybilnego pojemnika, takiego jak mikrocentryfuga lub rura poliimidowa, lub bezpośrednio na podstawie próbki.
  3. Sprawdź zgodność wymiarową z uchwytem robota, sprawdzając, czy zamontowana próbka mieści się w dopuszczalnych granicach wymiarowych, aby zapewnić bezpieczne uchwyty robota (patrz Rysunek 2):
    Opcja A: Pasuje do średnicy 8 mm x 20 mm wysokości.
    Opcja B: Pasuje do średnicy 3,5 mm x 33 mm wysokości.
  4. Upewnij się, że obie konfiguracje są scentralizowane na podstawie próbki. Upewnij się, że całkowita wysokość (próbka + mocowanie + podstawa) nie przekracza 27 mm lub 40 mm, w zależności od wybranej konfiguracji.
  5. Podczas mocowania próbek na kołkach SPINE, upewnij się, że próbka jest umieszczona na górze kołka, bez żadnej części zasłoniętej przez trzpień kołka. Próbka musi być zamontowana pionowo i centralnie na podstawie kołka, aby zapobiec kontaktowi z uchwytem robota. Jest to szczególnie ważne dla mocowania opcji B opisanego w sekcji protokołu 2.3, a także dla wydłużonych próbek zamontowanych na górze kołków.
  6. Podczas mocowania wewnątrz pojemników lub rurek, zabezpiecz próbkę mocno wewnątrz pojemnika, aby nie przesuwała się podczas transportu lub manipulacji robotem. Upewnij się, że sam pojemnik pozostaje pionowo wyrównany na podstawie próbki.
  7. Zamocuj wybrany element montażowy (kołek lub pojemnik) bezpiecznie i pionowo na podstawie próbki, aby zapewnić stabilność pozycyjną przez cały eksperyment.
  8. Użyj niezawodnego kleju lub metody mocowania, aby zapobiec oderwaniu się podczas wysyłki i automatycznej manipulacji, ponieważ oba procesy mogą wywoływać naprężenia mechaniczne.
    UWAGA: Powszechnymi klejami są cyjanoakrylany (super klej), wosk parafinowy i klej termotopiący. Skonsultuj się z personelem linii wiązki, jeśli masz wątpliwości dotyczące kompatybilności materiałów.
  9. Sprawdź, czy wszystkie próbki są ustawione na jednolitej wysokości od górnej krawędzi pojemnika lub na kołku. Dla próbek zamontowanych wewnątrz pojemników, upewnij się, że odległość boczna od ścianki pojemnika jest taka sama dla wszystkich próbek.
    UWAGA: Jednolite pozycjonowanie jest niezbędne do niezawodnego automatycznego wyrównania. Mniejsze próbki w stosunku do pola widzenia pozwalają na większą tolerancję.
  10. Zdokumentuj kod Data Matrix związany z każdą próbką, aby zapewnić poprawne identyfikowanie próbek podczas analizy danych.
  11. Wygeneruj plik samples.csv, aby powiązać każdą nazwę próbki z jej kodem Data Matrix na podstawie próbek i przekazać parametry istotne dla wykonywania skanów tomograficznych.

3. Pakowanie i dostarczanie próbek

  1. Najpóźniej 15 dni roboczych przed sesją eksperymentalną, przedłożono ocenę ryzyka eksperymentalnego (ERA) i zadeklarowano wszystkie próbki. Ta ERA musi zostać zatwierdzona

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 przedstawia robota do wymiany próbek Yaskawa GP7 zainstalowanego na linii obrazowania Diamond I13-2. Rysunek 1A przedstawia robota (1) oraz zaprojektowany wewnętrznie chwytak giętki (2). Chwytak ten może utrzymać próbkę o średnicy ≤ 8mm. Rysunek 1B przedstawia robota (1) oraz system optyki i kamery rentgenowskiej (4) i (6) wykorzystywany do pozyskiwania danych tomograficznych. Chwytak robota pobiera próbkę z tacy na próbki (3), która może pomieścić 7 uni-pucków z 16 próbkami na każdym z nich, co pokazano na Rysunku 1C. Próbki są zamontowane na aluminiowym trzpieniu (5), a akwizycja danych tomograficznych jest przeprowadzana za pomocą systemu detekcyjnego (6). Szczegóły dotyczące elementów (5) i (6) znajdują się w ostatnim akapicie sekcji wprowadzenia. Czerwona przerywana linia na Rysunku 1B wskazuje kierunek wiązki promieni rentgenowskich.

Szczegóły schematu montażu próbki oraz konstrukcji chwytaka giętkiego przedstawiono na Rysunku 2. Rysunek 2A przedstawia cylindryczną plastikową próbkę, wykonaną za pomocą druku 3D, przyklejoną do podstawy próbki. Granica próbki reprezentuje obrys maksymalnej wysokości i średnicy próbki. Czerwone strzałki wskazują miejsce, w którym chwytak giętki trzyma podstawę próbki, aby przenieść ją z tacki na próbki na stół tomograficzny i odwrotnie. Projekt 3D chwytaka giętkiego przedstawiono na Rysunku 2B. Palce chwytaka są napędzane przez pneumatycznie sterowaną rurkę napędową (Rysunek 1B, pozycja 2). Przestrzeń centralna w chwytaku ma średnicę 8,9 mm, jak pokazano na Rysunku 2C, co pozwala na zastosowanie próbki o maksymalnym rozmiarze 8 mm z marginesem ok. 1 mm. Rysunek 2D przedstawia widok górnej części stołu tomograficznego. Na szczycie dwóch ortogonalnych stopni zamontowany jest aluminiowy trzpień oraz tarcza magnetyczna, której średnica jest dokładnie dopasowana do wgłębienia na spodzie podstawy próbki. Ponieważ tarcza ta jest magnetyczna, stabilnie utrzymuje zamontowaną podstawę próbki podczas pomiarów tomograficznych.

W tym reprezentatywnym eksperymencie wybrano 64 próbki owadów udostępnione przez Muzeum Historii Naturalnej (NHM) w Londynie. Okazy dobrano tak, aby reprezentowały szeroki zakres fenotypów stawonogów, mieszcząc się jednocześnie w ograniczeniach rozmiarowych chwytaka. Ponieważ stawonogi, a w szczególności owady, stanowią ogromną większość znanej różnorodności gatunkowej (ponad 1 milion nazwanych gatunków), ich pobieranie do porównawczych badań fenotypowych jest szczególnie wymagające. Przedstawiona próba demonstruje zatem potencjał tej metody poprzez pobranie próbek z trzech kladów stawonogów na poziomie klasy: Arachnida, Entognatha i Insecta, a także poprzez bardziej szczegółowy dobór w obrębie owadów, aby uchwycić zmienność w siedmiu rzędach, w tym w czterech z najbogatszych gatunkowo rzędów żyjących obecnie. Okazy przymocowano do kartonika za pomocą kleju. Kartoniki zamontowano następnie na pinach do próbek. Unika się montowania próbek (owadów) bezpośrednio na pinach, ponieważ obecność struktury o wysokiej absorpcji w wiązce przy próbkach o niskiej absorpcji powodowałaby artefakty w postaci smug podczas rekonstrukcji; dodatkowo trudne byłoby ich bezpieczne zamocowanie na pinach. Tabela 1 przedstawia szablon pliku samples.csv, który użytkownik wypełnia wymaganymi parametrami tomografii (kolumny A, B, C, E, F, G, H, K). Opis każdej z kolumn znajduje się w tabeli. Kolumny D, I, J i L w pliku input_file są wypełniane po wyrównaniu i optymalizacji parametrów tomografii na linii wiązki. Wszystkie 64 próbki zostały najpierw zmierzone z obiektywem 1,25x (FOV 6,7 mm x 5,6 mm) przy zoptymalizowanej odległości propagacji promieni rentgenowskich (od próbki do detektora), a następnie te same próbki zmierzono z obiektywem 4x, stosując jego własne zoptymalizowane parametry. Po załadowaniu próbek na tackę i zabezpieczeniu komory eksperymentalnej, skanowanie jest uruchamiane za pomocą GDA.

Automatyczne wyrównanie próbki zostało wykonane za pomocą skryptu napisanego w języku Python (Lokalizacja pliku na GitHub: https://gist.github.com/ndg63276/9b3c5cfe7db26b14930dff3ef889e2bc). W pierwszej kolejności wyrównanie próbki jest konfigurowane przy użyciu kombinacji podstawy i pinu do próbki, bez właściwej próbki. Rycina 3 przedstawia pin do próbki widziany przez boczną kamerę teleskopową (kamera ustawiona pod kątem 90° względem wiązki promieni rentgenowskich – Rycina 1B, pozycja 4), która służy jako standardowa próbka do wyrównania. Obraz z kamery teleskopowej jest binaryzowany, aby umożliwić wykrycie próbki na tle tła. Krawędzie próbki są wyznaczane i zaznaczane jako biała granica, jak pokazano na Rycynie 3. Referencyjna pozycja współrzędnych próbki to góra pinu zaznaczona białym kołem na wstawce do Ryciny 3A. Analizując obraz rentgenowski, ROI próbki jest pozycjonowane na COR, a wymagana docelowa pozycja współrzędnych, zaznaczona niebieskim dwustronnym krzyżem ze strzałkami z czerwoną kropką (Rycina 3B), jest wyznaczana na kamerze bocznej. Takie ustawienie pozycji docelowej pozwala na umieszczenie próbki nie tylko na COR, ale także o kilka mm wyżej/niżej lub nieco poza centrum, jeśli jest to konieczne. Po załadowaniu próbki na stolik tomograficzny uruchamiana jest funkcja automatycznego centrowania. Skrypt najpierw przesuwa próbkę do pozycji docelowej (Rycina 3B) i ustawia kąt 0°. Następnie przesuwa próbkę do 90° (Rycina 3C) i określa, o ile próbka musi zostać przesunięta, aby umieścić ją w centrum rotacji (COR). Zazwyczaj zajmuje to około 15-20 s. Próbka znajduje się teraz na COR (Rycina 2D), a COR został już wyrównany z centrum kamery. System jest teraz gotowy do akwizycji tomograficznej.

W niniejszym badaniu owadów w NHM wykonano 128 skanów tomograficznych bez ingerencji człowieka. Pomiar trwał łącznie 17 h. Każdy skan trwał około 8 min. Taki eksperyment bez użycia robota wymagałby około 20 do 25 min na jeden skan tomograficzny. Oznacza to, że w tym przypadku skanowanie tomograficzne z użyciem robotów jest 3-4 razy szybsze niż skanowanie ręczne. Tabela 2 przedstawia typowy plik dziennika generowany po zakończeniu serii skanów robotycznych, zawierający parametry niezbędne do powiązania numeru każdego skanu z odpowiadającą mu próbką. Dodatkowe szczegóły znajdują się w legendzie do Tabeli 2.

Rycina 4 przedstawia znormalizowane obrazy projekcyjne jednej z próbek, owada (klasa Insecta, rzad Coleoptera), obrazowanego podczas wspomnianego wyżej eksperymentu tomograficznego przy powiększeniu 1,25x oraz 4x. Górny rząd, Rysunek 4A-C, przedstawia próbkę obrazowaną przy powiększeniu 1,25x, a następnie tę samą próbkę obrazowaną przy powiększeniu 4x, tj. Rysunek 4D-F. Rysunek 4 A–F przedstawia obrazy projekcyjne pozyskane pod kątami 0°, 90° i 180°. Żółty prostokąt wyznacza pole widzenia (FOV) dla powiększonych obrazów projekcyjnych, które zarejestrowano przy użyciu obiektywu 4x. Należy zwrócić uwagę, że po umieszczeniu próbek na tacy pokazanej w Rysunek 1Cwszystkie procesy przebiegały bez żadnej ingerencji człowieka. Należy zauważyć, że dwa te skany zostały wykonane w odstępie około 8,5 h. Świadczy to o stabilności i powtarzalności układu.

Rysunek 5 przedstawia poziome lub poprzeczne przekroje z zestawu przekrojów rekonstrukcji tomograficznej próbki wspomnianej na Rysunku 4. Zarówno przekroje 1,25x (Rysunek 5A), jak i 4x (Rysunek 5B) zostały przedstawione bez przycinania obrazów i mają wymiary 2510 x 2510 pikseli. Przekroje są dobrze wycentrowane w polu widzenia (FOV), co wykazuje, że powiększenie regionu przy wyższej magnifikacji jest możliwe bez konieczności jakiejkolwiek interwencji fizycznej.

Przedstawione tutaj wyniki wykazują, że wdrożenie systemu robotycznego do wymiany próbek w eksperymentach z mikrotomografii synchrotronowej zapewnia kilka istotnych zalet. Należą do nich zwiększona przepustowość, poprawiona efektywność operacyjna oraz możliwość przeprowadzania skanów przy wielu powiększeniach (zoom‑in) bez konieczności interwencji człowieka. Biorąc pod uwagę liczbę próbek wymagających zeskanowania, na przykład w przedstawionym tutaj badaniu NHM, uzyskanie statystycznie wiarygodnych i spójnych wniosków poprzez skanowanie ręczne byłoby niemożliwe.

Ramiona robotyczne w układzie do dyfrakcji rentgenowskiej; ładowanie próbek, zautomatyzowany proces analizy, krystalografia.
Rycina 1: Zdjęcie robota i eksperymentalnego układu do tomografii zainstalowanego w linii wiązki I13-2. (A) Robot (1) z chwytakiem sprężystym (flexure gripper) (2) własnej konstrukcji. (B) Taca do ładowania próbek (3) oraz scena tomograficzna (5). Kamera optyczna (kamera teleskopowa), oznaczona jako (4), służy do ustawiania próbek względem COR. System detekcji (6) wykorzystywany do pomiarów zawiera wiele zmotoryzowanych obiektywów do automatycznej zmiany pola widzenia oraz detektor pco.edge 5.5. Czerwona przerywana strzałka oznacza kierunek wiązki promieni rentgenowskich. (C) Zdjęcie tacy do ładowania próbek z 7 kasetami (pucks); każda kaseta może pomieścić do 16 próbek zamontowanych na kombinacji podstaw i pinów do próbek. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Układ tomograficzny: zamocowana próbka, konstrukcja chwytaka, stolik i narzędzia analityczne na schemacie i zdjęciach.
Rysunek 2: Szczegóły schematu montażu próbki i konstrukcji chwytaka giętkiego. (A) Zdjęcie wydrukowanej w technologii 3D plastikowej próbki zastępczej zamontowanej na podstawie próbki, reprezentującej maksymalną obrys próbki, jaką może obsłużyć chwytak giętki. Czerwone strzałki wskazują miejsce, w którym chwytak trzyma podstawę próbki. (B) Projekt 3D chwytaka giętkiego. Palce chwytaka są uruchamiane w celu przytrzymania lub zwolnienia podstawy próbki. (C) Rysunek przekroju pionowego chwytaka z wymiarami. Maksymalne otwarcie w centrum wynosi 8.9 mm; w związku z tym maksymalny dopuszczalny rozmiar próbki wynosi ≤ 8mm. (D) Zdjęcie górnej części stolika tomograficznego. Aluminiowy trzpień (wskazany niebieską strzałką) jest zamontowany na górze dwóch ortogonalnych stolików. Do górnej części trzpienia przymocowano tarczę magnetyczną, na której chwytak pozycjonuje podstawę próbki (z próbką). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat procesu wyrównania; pozycjonowanie celu przy 0° i 90°; precyzyjna konfiguracja; kalibracja celu.
Rysunek 3: Zrzuty ekranu z wykresu wideo procedury wyrównywania COR przy użyciu kamery teleskopu bocznego. (A) Zdjęcie pinu wyrównującego tuż przed rozpoczęciem rutyny wyrównywania. Niebieski dwukierunkowy krzyż z czerwonym punktem w centrum to pozycja celu, która pokrywa się z COR stopnia rotacji tomografii. Wstawka przedstawia powiększony obraz górnej części pinu, wskazujący wykryte centrum próbki, zarówno w wysokości, jak i szerokości. (B) Pin wyrównany do pozycji celu przy 0°. (C) Pin obrócony o 90°, znajduje się poza pozycją celu. (D) Pin wyrównany do pozycji celu przy 90°. Obecnie pin jest wyrównany w obu kierunkach ortogonalnych; w związku z tym próbka będzie obracać się w centrum kamery. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Seria obrazów mikroskopowych, analiza powiększenia i orientacji, badanie anatomiczne owada.
Rycina 4: Znormalizowane obrazy projekcyjne owada zebrane przy użyciu obiektywów 1,25x i 4x. Owad należał do klasy Insecta, rzędu Coleoptera. Przedstawiono dwa ze 128 skanów tomograficznych. Owad został przyklejony do papieru i przymocowany do szpilki do próbek. Obrazy projekcyjne z obiektywem 1,25x znajdują się w punktach (A) 0°, (B) 90°, (C) 180°, a z obiektywem 4x w punktach (D) 0°, (E) 90° oraz (F) 180°. Zestawy skanów tomograficznych 1,25x i 4x zostały zebrane w jednej sesji bez ingerencji człowieka. Zestaw obrazów z powiększeniem 1,25x zapewnia pełny widok próbki, a zestaw 4x demonstruje możliwość powiększenia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obraz mikroskopowy przekroju biologicznego, powiększenia 1,25x i 4x, struktura komórkowa.
Rysunek 5. Porównanie identycznego przekroju tomograficznego uzyskanego przy użyciu dwóch różnych pól widzenia. Pojedynczy zrekonstruowany przekrój z tomografii obrazów projekcyjnych przedstawionych na Rysunku 4 dla powiększeń (A) 1,25x oraz (B) 4x. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela 1: Typowy plik samples.csv dostarczany przez użytkownika, zawierający parametry tomografii. Plik ten jest odczytywany przez skrypt Pythona tomomatic wykorzystywany do akwizycji danych. Kolumny A (opis próbki), B (ID pucka), C (slot w pucku), E (krok rotacji tomografii), F (liczba FI), G (liczba DI), H (stosowane powiększenie) oraz K (priorytet slotu) są wypełniane przez użytkownika. Kolumny D (czas ekspozycji), I (odległość propagacji promieni X między próbką a kamerą), J (ruch kamery w poprzek wiązki w celu ustawienia COR w centrum kamery) oraz L (kod kreskowy podstawy próbki) są wypełniane po wyrównaniu i wstępnej optymalizacji. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Typowy plik dziennika wyjściowego zapisany jako Output_file.txt po zeskanowaniu wszystkich próbek. Plik raportuje wszystkie parametry wejściowe, a ponadto zawiera kod kreskowy zeskanowanej próbki (kolumna M), ścieżkę do zeskanowanych metadanych i plików obrazów (kolumna N) oraz pozycję silnika wykorzystanego do zbierania FI (kolumna O). W zasadzie plik wyjściowy ten dostarcza informacji niezbędnych do rekonstrukcji i analizy danych. Ponieważ w kolumnie A pliku wejściowego nie podano żadnych danych, kolumna ta została wypełniona aktualnym licznikiem skanowania wraz z numerami pucków i pinów. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Plik uzupełniający 1: Pseudokod opisujący skrypt wykorzystany do obsługi robota jako wymiennika próbek. Plik zawiera opis rutyny automatycznego montażu próbek, odczytywania kodów Data Matrix, automatycznego wyrównania próbek oraz wykonania skanowania tomograficznego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 1: Zrzut ekranu ogólnego interfejsu graficznego (GUI) do akwizycji danych.Interfejs ten umożliwia regulację podstawowych parametrów kamery, wizualizację próbki w czasie rzeczywistym oraz inicjowanie akwizycji tomograficznych. Skanowanie można rozpocząć za pomocą przycisku na ekranie (wyłącznie skanowanie ręczne) lub poprzez interfejs wiersza poleceń, zaznaczony żółtym prostokątem w dolnej części środkowej zrzutu ekranu.Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.

Rycina uzupełniająca 2: Fotografia standardowego krążka (Puck) SPINE (po lewej) oraz nakrętki do krążka (Puck Cap) (po prawej). Pozycje pinów, zaznaczone na czerwono, na których zamontowane są podstawy próbek, są ponumerowane zaczynając od pozycji przeciwległej do wcięcia na centralnym słupku mocującym. Numer 7267 (zaznaczony na biało) to numer identyfikacyjny krążka. Nakrętkę do krążka można zamontować na krążku, aby chronić próbki podczas transportu lub przechowywania. Przed próbą założenia nakrętki należy upewnić się, że rozmiary próbek są z nią kompatybilne.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przygotowanie próbki i wyrównanie próbki to dwa kluczowe kroki dla poprawnego i skutecznego działania automatycznego robota do zmieniania próbek11. Wymagania dotyczące wielkości próbki i montażu są podanych w Sekcji 2 (Protokół). Zasadniczo, średnica próbki musi wynosić 8 mm lub mniej i musi być dobrze wyśrodkowana na podstawie próbki12. To ograniczenie jest ustalane przez wymiary chwytaka. Ponadto, wszystkie próbki w pojedynczym pomiarze muszą znajdować się na tej samej wysokości, aby pozycjonowanie próbek w centrum obrotu było spójne dla wszystkich próbek. Jeśli robot został wyalinowany dla eksperymentu, to uruchomienie kolejnego eksperymentu z robotem do zmieniania próbek jest całkowicie zautomatyzowane, z wyjątkiem ustawienia obszaru zainteresowania dla próbki. To jest wyjaśnione w sekcji wyników reprezentatywnych, Rysunek 3. Należy również zauważyć, że jest to część procesu wyrównania wykonywanego przez personel linii wiązki (kontakt lokalny). Po jego ustawieniu, wszystkie pomiary próbek są wykonywane bez interwencji człowieka. Z perspektywy użytkownika, pomiary są całkowicie zautomatyzowane. Do tej pory, używane są tylko podstawy próbek i igły do próbek od firmy Molecular Dimensions Ltd; jednakże, są inni dostawcy, takich jak MiTeGen i Hampton Research, którzy produkują podstawy i igły do próbek w stylu SPINE.

Większe chwytaki do próbek, zaprojektowane do trzymania próbek o średnicy do 12 mm, są obecnie w fazie rozwoju i testów. Pozwoli to robotowi na obsługę większych próbek, takich jak te umieszczone wewnątrz mikrocentrówek i zamontowane na podstawie próbki. Ulepszony projekt chwytaka mógłby obejmować mechanizm, który podchodzi do próbki z boku, eliminując tym samym obecne ograniczenia dotyczące wielkości próbki. Ponadto, modernizacja linii wiązki zwiększy przepustowość o rząd wielkości, umożliwiając skanowanie ponad 3000 próbek dziennie. To z kolei pozwoli na zebranie statystycznie istotnych zestawów danych obejmujących około 30 000 próbek w ciągu 10 dni czasu na wiązce. W najbliższej przyszłości wdrożymy nową linię do rekonstrukcji tomografii, zwaną HTTomo.

Należy zauważyć, że parametry takie jak odległość propagacji wiązki (odległość od próbki do detektora), czas ekspozycji, liczba projekcji itp. muszą być zoptymalizowane wcześniej, jak w każdym innym eksperymencie tomografii synchrotronowej z wykorzystaniem promieni X. Kolejnym ograniczeniem jest to, że etapy zaangażowane w eksperyment, takie jak 6-osiowa manipulacja próbkami, etapy tomograficzne i etapy manipulacji kamerą, muszą znajdować się w określonej, zdefiniowanej pozycji dla ładowania i rozładowywania próbek. Oznacza to, że etapy muszą być przemieszczane w tam i z powrotem, gdy ma miejsce ładowanie i rozładowanie próbek.

Podsumowując, tomografię o wysokiej przepustowości można wykonać za pomocą robota do zmieniania próbek, co sprawia, że proces jest co najmniej 4-10 razy szybszy i zmniejsza lub eliminuje czas marny w porównaniu z ręczną operacją. Automatyzacja eksperymentu z robotami pozwala również na bardziej efektywne wykorzystanie personelu, ponieważ mniej osób jest potrzebnych do przeprowadzania pomiarów. Pomiar statystycznie istotnych zestawów danych jest ważny dla wielu dziedzin naukowych, w których wymagana jest niezawodna i wystarczająca objętość danych, aby rozwiązać przypadek naukowy. Użycie robota może znacznie pomóc w takich zadaniach.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcą podziękować Chrisowi Charlesworthowi, Andy'emu Peachowi, Ljubo Zaję, Markowi Hooperowi, Russellowi Marshallowi, Simonowi Loganowi i Timowi Ardernowi z Diamond Light Source za pomoc w projektowaniu uchwytu zgięciowego i instalacji robota. Autorzy z okazji dziękują Diamond Light Source (DLS) za czas wiązki na I13-2 (cm28141-3). Dziękujemy Martinowi Walshowi i działowi nauk przyrodniczych za porady i wsparcie w zakresie zakupu, instalacji i uruchomienia robota. Dużą wdzięczność wyrażamy Markowi Williamsowi z Diamond Light Source za dostarczenie skryptu do centralnego centrowania próbek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Air-bearing rotation stageAerotech, Inc.https://www.aerotech.com/wp-content/
uploads/2021/01/abrt-data-sheet.pdf		Tomography rotation stage
AVIZOThermoFisher scientific Commercialne oprogramowanie do wizualizacji i analizy danych
Cryocap -MiTeGenMiTeGen LLChttps://www.mitegen.com/product/
reusable-goniometer-base-styles/		Alternatywny dostawca CryoCap
CryoCap-Hampton researchHampton researchhttps://hamptonresearch.com/
product-CrystalCap-SPINE-HT-445.html		Alternatywny dostawca CryoCap
Cryocaps( MD7-401) and Cryopins(MD7-410)Calibre Scientifichttps://www.moleculardimensions.com/
products/magnetic-cryovials-and-cryocaps		Używane do montażu próbek
Detector OpticsOlympus/Evident Scientifichttps://evidentscientific.com/en/objective-finder?
creative=651972731238&keyword
=olympus+objectives&matchtype=
e&network=g&device=c&campaign
id=19865307548&adgroupid=144
087466781&gad_source=1&gad_
campaignid=19865307548&gbraid
=0AAAAADMIOOmWDa2WC5VP2
Ngxlqao8dyWe&gclid=Cj0KCQiAhtv
MBhDBARIsAL26pjFYUqjLVZ1Miz
p2W7eGzD2SEPNTjxiA87Dry6un
1Fx6GplHQjuBR94aAs1xEALw_wcB		Obiektyw i fotookularka
GDADiamond Light Source Ltd.https://www.diamond.ac.uk/Users/Experiment
-at-Diamond/IT-User-Guide/Software/Data-Acq/GDA.html		Oprogramowanie do ogólnego pozyskiwania danych
HexapodPI miCos GmbHhttps://www.physikinstrumente.co.uk/en/pro
ducts/6-axis-hexapods-parallel-positioners		6-osiowy stół do wyrównania tomografii i manipulacji próbkami
ImageJOpracowane w National Institutes of Health, University of Wisconsinhttps://imagej.net/ij/Oprogramowanie do przetwarzania i wizualizacji obrazów typu open source
pco.edge 5.5 sCMOS cameraPCO (PCO AG / Excelitas Technologies)https://www.excelitas.com/product-category/
pcoedge-cooled-scmos-cameras		Kamera rentgenowska stosowana do obrazowania tomograficznego
SAVUDiamond Light Source Ltd.https://www.diamond.ac.uk/Home.html
;jsessionid=8977FA8A10694BFA2AA
DFD5D0D23B320		Rury przetwarzania tomografii
ScintillatorsCRYTUR, spol. S r.ohttps://www.crytur.com/materials/luag-ce/Optyka scyntylacyjna
Universal V1-puck( Uni-puck)Calibre Scientifichttps://www.moleculardimensions.
com/products/uni-pucks-and-accessories		Próbki są montowane na Uni-puck, aby robot je odbierał

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. . Heavy Industry Equipment Automation Available from: https://www.rockwellautomation.com/en-us/capabilities/machine-equipment-builders/heavy-industry-equipment-automation.html (2025)
  2. . Totally Integrated Automation (TIA) Available from: https://www.siemens.com/global/en/products/automation/topic-areas/tia.html (2025)
  3. . Robotic Integration for Heavy Industrial Applications Available from: https://www.genesis-systems.com/robotic-integration-heavy-industrial (2025)
  4. Teagully, H., San, J. E., Giandhari, J., de Oliveira, T. Unlocking the efficiency of genomics laboratories with robotic liquid-handling. BMC Genomics. 21 (1), 729 (2020).
  5. de Smet, M. D., Naus, G. J., Faridpooya, K., Mura, M. Robotic-assisted surgery in ophthalmology. Curr Opin Ophthalmol. 29 (3), 248-253 (2018).
  6. Panara, K., Shahal, D., Mittal, R., Eshraghi, A. A. Robotics for cochlear implantation surgery: challenges and opportunities. Otol Neurotol. 42 (7), e825-e835 (2021).
  7. Callaway, E. Lab automation: Scientists bet big on AI and robotics. Nature. , (2020).
  8. Als‑Nielsen, J., McMorrow, D. . Elements of Modern X‑ray Physics. , (2011).
  9. Rau, C., Wagner, U., Pešić, Z., De Fanis, A. Coherent imaging at the Diamond beamline I13. Phys Status Solidi A. 208 (11), 2522-2525 (2011).
  10. Pešić, Z. D., De Fanis, A., Wagner, U., Rau, C. Experimental stations at I13 beamline at Diamond Light Source. 425, 182003 (2013).
  11. Marathe, S., Ziesche, R. F., Das, G., Schroeder, S. L. M., Baird, E., et al. High-speed grating interferometry. Proc SPIE. 11840, 118400L (2021).
  12. Rau, C., et al. Operando and high-throughput micro and nano-tomography. Proc SPIE. 11840, 118401E (2021).
  13. De Carlo, F., Xiao, X., Tieman, B. X-ray tomography system, automation, and remote access at beamline 2-BM of the Advanced Photon Source. Proc SPIE. 6318, 63180K (2006).
  14. Mader, K., et al. High-throughput full-automatic synchrotron-based tomographic microscopy. J Synchrotron Radiat. 18, 117-124 (2011).
  15. Albers, J., et al. High-throughput tomography (HiTT) on EMBL beamline P14 at PETRA III. J Synchrotron Radiat. 31, 186-194 (2024).
  16. . High Throughput Tomography at IPS Available from: https://www.ips.kit.edu/5925.php (2025)
  17. Rau, C. Imaging with coherent synchrotron radiation: X‑ray imaging and Coherence Beamline (I13) at Diamond Light Source. Synchrotron Radiat News. 30 (5), 19-25 (2017).
  18. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1251-1259 (2006).
  19. Wadeson, N., Basham, M. A framework for scientific data management. arXiv. , (2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bioin ynieriaWydanie 233Wydanie 233Warto pustaWydanieObrazowanie synchrotronoweTomografiaObrazowanie rentgenowskieAutomatyzacjaTomografia wysokoprzepustowaObrazowanie wysokiej szybko ci
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły